Dopo aver eseguito l'imaging del C.elegane trattato con farmaci, aprire il file ND nel server immagine J con il plug-in di colocalizzazione e selezionare l'opzione di divisione delle immagini nella finestra di dialogo. Ogni file ND contiene piani di immagine presi a tre lunghezze d'onda e luce visibile. Lavora con immagini in campo chiaro, verdi e rosse.
Generare duplicati di queste immagini per mantenere intatta l'immagine originale facendo clic sull'immagine e selezionando duplica o utilizzando la scorciatoia da tastiera più D.Quindi ridurre lo sfondo generando un'altra immagine duplicata come dimostrato in precedenza. Sottrarre lo sfondo con un raggio di rotazione di 100 e selezionare l'opzione Crea sfondo per generare un'immagine con lo sfondo dell'immagine specificata. Ora vai al processo, fai clic su calcolatrice di immagini e sottrai la prima immagine duplicata dalla seconda immagine duplicata.
Utilizzare le immagini risultanti per l'analisi di colocalizzazione. Per utilizzare il plug-in di colocalizzazione, convertire le immagini del canale verde e rosso in otto bit facendo clic su immagine, selezionando tipo, seguito da otto bit. Quindi, fai clic su plugin e seleziona la colocalizzazione.
Per misurare la colocalizzazione dei segnali dei mitocondri e dei lisosomi, impostare il rapporto al 75%, il canale rosso soglia a 80,0 e il canale verde soglia a 50,0. Un'immagine binaria a otto bit contenente punteggiatura colocalizzata e combinando le tre immagini a otto bit in un'immagine RGB viene generata come output. Quindi, concentrati sul puncta nel muscolo della parete del corpo della testa dei vermi selezionando manualmente l'area e creando una maschera facendo clic su modifica, seleziona e crea maschera per selezionare la regione di interesse.
Per selezionare le particelle nella regione di interesse, utilizzare il calcolatore di immagini per selezionare le immagini colocalizzate a otto bit e mascherate. Utilizzare l'operazione e selezionare il puncta nella regione di interesse generando un'immagine con puncta nella regione di interesse. Infine, per analizzare l'area dei mitocondri e dei lisosomi colocalizzati, selezionare analizza, seguito da analizzare le particelle e misurare la somma della puncta tra 0,1625 micrometri quadrati e quattro micrometri quadrati.
Le immagini confocali dei muscoli della parete del corpo della testa dei vermi hanno mostrato la colocalizzazione dei mitocondri e dei lisosomi. VL-850 ha indotto una robusta mitofagia nei muscoli della parete del corpo della testa del verme, indicando un potente induttore mitofagia. La potenza mitofagia di VL-850 era simile a quella di FCCP.
