Iniziate inoculando i ceppi di lievito competenti per il controllo e la ricombinazione delle piastre YPD in cinque millilitri di terreno YPR e coltivate la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius e 200 RPM. Successivamente, aumenta la coltura inoculando due millilitri in 100 millilitri di terreno YPR fresco e facendolo crescere durante la notte a 30 gradi Celsius e 200 RPM. Per ogni ceppo, erogare 1.800 millilitri di terreno peptone di lievito in autoclave e 200 millilitri di soluzione di raffinosio al 20% in autoclave in due palloni Erlenmeyer da 5 litri.
Inoculare ogni ceppo di lievito con una densità ottica di 0,2 a 600 nanometri nel rispettivo terreno e incubare per circa sei ore a 200 giri/min o fino a quando le cellule non raggiungono la densità ottica desiderata di 1,0. Aggiungere contemporaneamente 200 millilitri di galattosio al 2% e 110 microlitri di fattore di accoppiamento alfa o YMFA del lievito per arrestare le cellule nella fase G1 e incubarla per due ore. Trasferire la sospensione cellulare in secchi da centrifuga da un litro e centrifugare il secchio a 6.000 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Scartare il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 10-15 millilitri di acqua distillata. Quindi, sigilla una siringa da 25 millilitri con un tappo per esca e mettila all'interno di un tubo conico da 50 millilitri riempito d'acqua. Trasferire la sospensione cellulare nel gruppo siringa.
Lavare i secchi della centrifuga con cinque millilitri di acqua distillata per raccogliere le cellule rimanenti. Quindi, centrifugare il gruppo a 2, 397 G per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Quindi rimuovere il tappo di esca dalla siringa ed estrudere le cellule in azoto liquido per formare gli spaghetti cellulari.
Infine, trasferisci gli spaghetti congelati in un tubo conico da 50 millilitri e conservalo a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.
