Purificazione della cromatina del locus genico a copia singola in Saccharomyces cerevisiae

Un nucleo eucariotico è molto affollato con molti processi biologici che avvengono contemporaneamente. Lo scopo della nostra ricerca è quello di capire come tutti questi processi siano coordinati sui nostri genomi senza incidenti importanti che altrimenti porterebbero a instabilità genomica e malattie umane. Questo protocollo ci permette di purificare un locus specifico del genoma nel suo stato nativo, permettendo sia la caratterizzazione composizionale che funzionale del materiale isolato, come ad esempio le misure delle interazioni del DNA proteico.

Questo protocollo consente un enorme livello di arricchimento di un locus mirato, che supera molte limitazioni attuali dell'isolamento della cromatina locus-specifica. Il materiale non è stato reticolato. Ciò consente anche molte analisi funzionali a valle, come la trascrizione in vitro o la replicazione in vitro.

Questo protocollo ci ha permesso di asportare e purificare distinte origini di replicazione dai cromosomi del lievito, consentendoci di eseguire un'analisi proteomica e identificare nuovi fattori di cromatina che interagiscono con l'origine e, quindi, far progredire il campo di ricerca della replicazione del DNA. Questo protocollo consente studi di replicazione in vitro utilizzando il materiale di origine purificato per esaminare gli stati della cromatina, le modificazioni istoniche ed eseguire analisi strutturali sui modelli nucleosomiali nativi dei cromosomi endogeni, facendo progredire la ricerca sulla cromatina.