Rilasciare i complessi dell'anello della cromatina lexA CBP dalle perle magnetiche utilizzate per purificare il locus genico a copia singola della cromatina incubando le api con due microlitri di virus dell'incisione del tabacco ricombinante marcato con 6xHis, o proteasi TEV. Dopo aver separato le api dall'eluato finale utilizzando un trasferimento magnetico a rack, l'eluato contenente la cromatina scissa si collega a una nuova provetta di reazione da 1,5 millilitri. Anche in questo caso, posizionare le provette su una griglia magnetica per separare le perle residue dall'eluato finale.
Risospendere le perle in 750 microlitri di tampone di carbonato di ammonio freddo prima di conservare alcuni campioni a 20 gradi Celsius per l'analisi del DNA e delle proteine. Dall'eluato finale, prelevare i campioni e conservarli a 20 gradi Celsius per l'analisi del DNA e delle proteine. Inoltre, prelevare campioni dalle perle residue.
Iniziare l'eluizione della denaturazione lavando le microsfere magnetiche due volte in 750 microlitri di tampone di carbonato di ammonio freddo per 20 minuti ciascuna, ruotando di quattro gradi Celsius a 20 giri al minuto. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di idrossido di ammonio 0,5 molare alle perle per estrarre i complessi di cromatina lexA legati e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Separare le perle dalla sospensione utilizzando un rack magnetico e trasferire l'eluato in una provetta di reazione a basso legame.
Incubare la provetta di reazione a basso legame a temperatura ambiente per 30 minuti e separare le perle dalla sospensione utilizzando un rack magnetico. Una volta terminato, trasferire l'eluato in una provetta di reazione a basso legame. Risospendere le perle in 750 microlitri di acqua deionizzata e raccogliere campioni per l'analisi del DNA e delle proteine.
Infine, ottenere campioni di analisi del DNA e delle proteine dall'eluato finale. Nello studio, l'efficienza di purificazione del locus ARS316 e del ceppo di ricombinazione è stata quantificata e confrontata con il locus di controllo PDC1. Il locus ARS316 ha mostrato un recupero inferiore nel flusso rispetto a PDC1.
Sebbene una frazione degli anelli di cromatina sia rimasta legata alle perle di TEV a causa della scissione incompleta della proteasi TEV, l'eluizione per denaturazione ha portato a un recupero del locus ARS316 dell'80-90%. Ciò corrisponde all'elevato arricchimento delle molecole ARS316 nelle perle TEV e nelle frazioni di eluizione per denaturazione quando si tiene conto delle dimensioni del genoma del lievito rispetto al ceppo di controllo che non ha mostrato alcun arricchimento del locus ARS316 in nessuna delle frazioni quantificate. Dopo l'eluizione del TEV, le perle hanno mostrato una percentuale di recupero più elevata del locus ARS316 poiché l'efficienza di scissione del TEV non era del 100%, il che ha comportato che una frazione degli anelli di cromatina rimanesse legata alle perle.
Tuttavia, l'elusione denaturante ha mostrato un recupero dall'80 al 90% del locus ARS316 e del ceppo di ricombinazione corrispondente all'elevato arricchimento delle molecole ARS316 quando si tiene conto delle dimensioni del genoma del lievito.
