Iniziare lucidando a fuoco tre pipette di pascolo utilizzando un bruciatore bunsen, creando diametri decrescenti. Successivamente, sterilizzare l'addome di una madre di topo incinta sottoposta a eutanasia con etanolo al 70%. Tagliare la cavità addominale dalla sintesi pubica al processo xifoideo della gabbia toracica.
Ora, estrai il corno uterino dalla cavità addominale e mettilo in una piastra da 100 millimetri riempita con una soluzione ghiacciata di HBSS. Estrarre e separare tutti gli embrioni dall'utero lavato utilizzando una pinza fine. Decapita rapidamente gli embrioni di topo estratti e posiziona le teste in una capsula di Petri da 60 millimetri riempita di HBSS.
Posiziona un paio di pinze sottili nella cavità oculare per trattenere il cervello. Con un altro paio, sbucciare la pelle e il cranio fino a quando il cervello non è visibile. Estrai il cervello dai bulbi olfattivi dal cranio e capovolgilo.
Osserva la corteccia sul lato ventrale e l'ipotalamo sul lato dorsale. Usa una pinza curva per rimuovere lo strato di meningi e vasi sanguigni fino a quando il cervello non appare bianco e chiaro e separa l'area ipotalamica dal resto del cervello. Tagliare l'ipotalamo in tre o quattro piccoli pezzi fini e utilizzare una pipetta per trasferire i pezzi in una provetta da 15 millilitri.
Quindi, riempi il tubo con sei millilitri di HBSS. Quindi aggiungere Enzyme Mix 1 una volta che il tessuto si è depositato e il surnatante è stato rimosso. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti, agitando ogni cinque minuti per risospendere il tessuto.
A questo punto, aggiungere 30 microlitri di Enzyme Mix 2 e dissociare il tessuto pipettando su e giù 10 volte con una pipetta da pascolo di grande diametro. Dopo un'incubazione di altri 10 minuti, aggiungere i restanti 15 microlitri di Enzyme Mix 2. Utilizzando due pipette lucidate a fuoco di diametro decrescente, pipettare il tessuto 10 volte.
Aggiungere immediatamente 10 millilitri di HBSS con 0,5% di BSA al tubo. Quindi centrifugare la provetta a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di HBSS con 0,5% di BSA.
