Isolamento e cultura dei neuroni del Ganglione Ciliario

Il ganglio ciliare di pollo, è una struttura localizzata nella parte posteriore dell'occhio, adiacente al nervo ottico nella fessura coroide. E i neuroni ganglionari ciliari, appartengono al sistema nervoso parasimpatico, e sono neuroni colinergici, e quindi possono stabilire sinapsi colinergiche. Il ganglio ciliario è costituito da un'enorme popolazione di neuroni ciliari e neuroni coroidi, che sono strutturalmente e funzionalmente distinti.

Quindi i neuroni ciliari innervano il muscolo intraoculare, e i neuroni coroidi innervano il muscolo dell'umore negli occhi. E per i primi giorni di cultura, i neuroni ganglionari ciliari presentano una morfologia multipolare, e dopo questi, iniziano a passare a uno stato unipolare, dove uno dei neuriti si estende e forma l'assone. Uno degli studi più comuni che utilizzano neuroni ganglionari ciliari, è uno studio delle sinapsi neuromuscolari, che sono sinapsi colinergiche, e l'uso di neuroni ganglionari ciliari è diventato una buona alternativa, rispetto ai modelli precedenti, a causa del fatto che la popolazione neuronale ottenuta, è omogenea nel senso che, tutti i neuroni sono colinergici, e quindi possono stabilire sinapsi funzionali con le cellule muscolari , cosa che non accade quando lavoriamo con una popolazione neuronale, che non è del tutto colinergica.

L'identificazione e la dissezione del ganglio ciliario possono essere piuttosto impegnative per qualcuno che lo fa per la prima volta, quindi qui forniamo un protocollo passo dopo passo, per l'identificazione e la dissezione appropriate del ganglio ciliario, nonché le linee guida per una cultura di successo di questi neuroni. Per la preparazione delle coverlips, avrai bisogno di 13 coverlips di vetro millimetri, un contenitore resistente agli acidi, acido nitrico al 65%, pinzette, acqua Milli-Q, 75% etanolo e uno shaker orbitale. La preparazione delle copertine per le colture primarie, dovrebbe essere eseguita due giorni prima della procedura.

Posizionare il numero desiderato di coverlips di vetro, all'interno di un contenitore resistente agli acidi, e aggiungere il 65% di acido nitrico, fino a quando tutte le coverlips sono coperte. Posizionare il contenitore in uno shaker orbitale e incubare durante la notte a temperatura ambiente con agitazione. Il giorno dopo, rimuovere con cura l'acido nitrico e la stella per il riutilizzo.

Lavare i copripavimenti, aggiungere acqua Milli-Q al contenitore. Ancora una volta, posizionando l'agitazione per 30 minuti, scartare la soluzione di lavaggio e ripetere questo processo cinque volte. Risciacquare i copricapo due volte usando il 75% di etanolo.

Separare e posizionare accuratamente le singole coverlips in un rack metallico, coperto con un foglio di alluminio, e incubare a 50 gradi, per 10-15 minuti o fino a quando non sono completamente asciutti. Sterilizzare i coprispazzi nella luce UV, per 10-15 minuti. Per rivestire le coverlips, avrai bisogno di coverlips in vetro sterile, una piastra da 24 pozzetti, pinzette sterili, 0,1 milligrammi per soluzione PDL millilitro, acqua sterile, una soluzione laminina da 10 microgrammi per millilitro, mezzo neurobasale semplice e mezzo completo di ganglio ciliare.

Il rivestimento delle coverlips, deve essere fatto il giorno prima della procedura. Utilizzando una pinzetta sterile, posizionare un coverslip in ogni pozzo di una piastra da 24 pozzetti, aggiungere 500 microlitri di soluzione poli di analisi, a una concentrazione di 0,1 milligrammi per millilitro e incubare durante la notte a 37 gradi. Il giorno successivo, lavare le coverlips tre volte con acqua sterile, scartare l'acqua e aggiungere 350 microlitri della soluzione di laminina a una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro ad ogni pozzo.

Mettere in un'incubatrice, a 37 gradi per due ore. Dopo questo tempo, e prima della placcatura cellulare, rimuovere la soluzione di laminina e lavare due volte con 300 microlitri di mezzo neurobasale semplice. Aggiungere 300 microlitri di mezzo completo e posizionarli in un'incubatrice, a 37 gradi e 5%CO2, fino a quando non si è pronti a placcare le celle.

Per la procedura di dissezione, avrai bisogno di uova di gallina al settimo giorno embrionale, 75% etanolo, forcep di dissezione numero 545 e numero 55, forbici, un cucchiaio, piastre di Petri dissezione con fondo nero e soluzione HBSS ghiacciata. Assicurarsi di sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione in 75%etanolo. Le uova devono essere conservate a 16 gradi prima di essere incubate in un'incubatrice di uova, a 37,7 gradi, per sette giorni o in altri stadio embrionali desiderati.

Nel giorno della procedura, rimuovere le uova dall'incubatrice, spruzzare le uova con il 75% di etanolo. Prendi la parte superiore dell'uovo usando una forbice e tira fuori con cura l'embroy usando un cucchiaio. Posizionare l'embrione, in una piastra di Petri con soluzione HBSS ghiacciata, e separare immediatamente la testa dal corpo, tagliando nella regione del collo.

Quindi trasferire la testa in una nuova piastra di Petri con soluzione HBSS ghiacciata pulita. Non appena l'embrione viene rimosso dall'uovo, è in grado di produrre proteasi responsabili della morte cellulare. Quindi è importante separare la testa dal corpo il più rapidamente possibile, una volta che l'embrione è fuori dall'uovo per ridurre al minimo la morte cellulare.

È anche molto importante mantenere la testa dell'embrione nella soluzione HBSS ghiacciata. Tenere l'embrione a testa in su e fissarlo nel becco del pulcino, quindi iniziare a rimuovere il sottile strato di pelle intorno all'occhio. Con attenzione, rimuovere l'occhio ruotando delicatamente lontano dalla testa.

E mentre si separa l'occhio dalla testa del pulcino, notare il nervo ottico che viene sessato. Tenere l'occhio con il lato posteriore verso l'alto e notare il ganglio ciliario, adiacente al nervo ottico del sensore e alla fessura coroide. Il nervo prepartinico potrebbe ancora essere attaccato al ganglio ciliario, facilitandone l'identificazione.

Sezionare il ganglio ciliario, da ogni occhio, e pulirlo molto bene rimuovendo il tessuto in eccesso. Trasferire i gangli sezionati in una piastra di Petri con soluzione HBSS su ghiaccio. Per avere una resa di circa 1 milione di cellule per millilitro, dovresti sezionare circa 70 gangli, e anche tenere a mente che la popolazione cellulare ottenuta, ha anche cellule non neuronali, quindi per ridurre il numero di cellule non neuronali e anche per aumentare la purezza della tua popolazione neuranale, è importante pulire molto bene i gangliari cilia , rimuovendo tutto il tessuto in eccesso.

Per la dissociazione tissutale, avrai bisogno di una piastra 24-Well, soluzione 0.1% tripsin, mezzo ganglia ciliare incompleto, pipetta pasteur in vetro lucido al fuoco e pipetta pasteur in plastica. Pre-bagnare una pipetta pasteur di plastica sterile e raccogliere tutti i gangliari ciliari su un tubo da 15 ML e centrifugare per due minuti a 200 Gs.Con attenzione, rimuovere tutto il mezzo HBSS, utilizzando una pipetta pasteur per rimuovere un volume maggiore, quindi, quando si è più vicini al pellet, utilizzare una micro pipetta. Aggiungere un millilitro di soluzione 0,1% di tripsina e incubare per 20 minuti, a 37 gradi in un bagno d'acqua.

Centrifugare per due minuti, a 200 Gs.Immediatamente, rimuovere la soluzione di tripsina e aggiungere un millilitro di mezzo incompleto. Il siero nel mezzo incompleto, fermerà immediatamente l'attività della tripside. Centrifugare per due minuti, a 200 G, e rimuovere tutto il mezzo.

Aggiungere 500 microlitri di mezzo completo e iniziare la dissociazione tissutale utilizzando una micropipetta P1000. Inizia con la pipetta su e giù, da 10 a 15 volte, e poi passa a una pipetta pasteur in vetro lucido per il fuoco e, ancora, pipetta su e giù da 10 a 15 volte. La sospensione cellulare dovrebbe diventare sfocata, come segno di una dissociazione tissutale di successo.

Il volume necessario per dissociare le cellule dipende dal numero di gangliari ciliari ottenuti in questo e dalle dimensioni del pellet. Quando si tubazioni su e giù per dissociare un tessuto, è importante evitare le bolle d'aria di formazione, questo ridurrà al minimo la perdita cellulare. Dopo aver sospeso le cellule, è possibile lasciare la sospensione cellulare sul ghiaccio fino alla placcatura.

Determinare la densità cellulare utilizzando una soluzione blu trypan, nella camera neubauer. Quella sospensione di cellule di piombo in mezzo completo, con 5FTU, alla densità desiderata e piastra 500 microlitri di cellule per pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi e 5%CO2.

Assicurati di controllare la nostra cultura ogni giorno e seguire lo sviluppo delle cellule. Le cellule gangliari ciliari si sviluppano abbastanza velocemente in vitro, e dopo un giorno, possiamo già vedere alcuni neuriti che si estendono dal corpo cellulare. Dopo sette-otto giorni in vitro, la rete neuronale è molto ben consolidata e le cellule possono essere mantenute per almeno 15 giorni.

Dopo un giorno in vitro, i neuroni ganglionari ciliari mostrano una mitologia multipolare. Tuttavia, l'estensione dei neuriti avviene rapidamente nei neuroni visibilmente stabiliti la rete neuronale, già dopo 24 ore. In vitro, i neuroni ganglionari ciliari sono responsabili dell'innervazione del muscolo nell'occhio.

E quindi, queste culture neuronali, sono molto adatte per lo studio delle sinapsi neuromuscolari. Per questo, i neuroni ganglionari ciliari possono essere placcati sopra le cellule muscolari. Qui, mostriamo una cultura di successo, dei neuroni vitrei oculari, CG, sopra l'occhio V7 pulcino neuroni muscolari pectrali.

Il marcatore vescicolare sinaptico, SV2, mostra sinapsi attive che si vengono stabilite tra gli assoni dei neuroni CG e le fibre muscolari, facilmente identificabili dai nuclei multipli. I neuroni ganglionari ciliari ottenuti con questo protocollo sono adatti, tra gli altri, per l'immunocitochimica, l'elettrofisiologia e i saggi di sopravvivenza. Questo protocollo di dissezione, produce un numero molto basso di neuroni, ma se fatto correttamente, fornirà la popolazione pura di neuroni colinergici.

È molto importante che ogni gangli sia molto ben pulito e che il tessuto in eccesso venga rimosso. Per questo, dovrebbero essere utilizzati strumenti di alta qualità, in modo che questo tessuto possa essere rimosso al fine di prevenire la contaminazione da cellule non neuronali. L'età dell'embrione determinerà il successo del nostro protocollo.

Idealmente, la dissezione deve essere eseguita tra E7 ed E8. Questo momento è molto importante perché in questa fase, la morte cellulare dello sviluppo che si verifica normalmente in vitro non si è ancora verificata. Al fine di ridurre al minimo la contaminazione di queste cellule non neuronali, utilizziamo 5FTU nei mezzi di coltura per ridurre al minimo la crescita di cellule gliali e fibroblasti. Questo modello cellulare offre un'eccellente alternativa per studiare la malattia nueromusclar.

Sulla base di questo protocollo, ulteriori questioni scientifiche possono essere affrontate, ad esempio, come la localizzazione sub cell di carbonati specifici e proteine specifiche regola la formazione e la funzione della sinapsi. Inoltre, è abbastanza facile stabilire co-culture muscolari nervose per affrontare ulteriori domande come lo studio delle malattie neuromuscolari.