Ringraziamo C. Montojo, J. Reyes, e M. Armour per la consulenza e assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da US National Institutes of Health di sovvenzione F31 NS063550 (a DAL), un Premio Basilio O&#39;Connor Starter Scholar e sovvenzioni del Fondo Klingenstein e NARSAD (a SB). SB è un WM Keck Distinguished giovane studioso nella ricerca medica.

Uso Animal Ottenere l&#39;approvazione dal Comitato istituzionale, cura degli animali ed uso di protocolli di cura standard di utilizzo. Il protocollo attuale è stato sviluppato per studi di irradiazione focali 5,5-10 settimane di età adulte C57BL6 / J topi, come precedentemente descritto (Figura 2) 2. Tuttavia, altre epoche e le piccole specie animali (ratti, criceti, scoiattoli di terra, ecc) possono essere utilizzati anche, a condizione che i protocolli di anestesia efficaci e di un atlante di riferimento radiografici che consentono di identificare la regione di interesse (ROI) sono disponibili. 1. Taratura di TC guidata piattaforma radiologica Effettuare calibrature a pellicola per dose di radiazioni sulla piattaforma radiologica in anticipo per ciascun formato collimatore e tipo di filtro tubo radiogeno utilizzato. Al fine di indirizzare un fascio di irradiazione arco al sito bersaglio desiderato, utilizzare la radiazione software dose-pianificazione 49 dispone sulla maggior parte delle piattaforme di radiazione commerciali per calcolare i tempi di consegna necessaria in base alla dose di radiazione, la profondità della regione di interesse (ROI) basato su TC del mouse e la velocità di rotazione della piattaforma robotica; dettagli su questo sono lasciati fuori di questo protocollo in quanto essi differiscono tra le piattaforme di radiazione. Ai fini della visualizzazione del ventrobasal ipotalamo 2 (Figura 3) con TC, azionare il tubo radiogeno con macchia focale 0,4 mm ed energia del fascio 100 kVp con 1 mm Al filtrazione. Per irradiazione focale del HZP azionare il tubo radiogeno a 225 kVp, 13 mA, e un punto focale 1 mm con filtrazione 0,15 mm e Cu, per fornire 10 Gy di radiazioni tessuti a una profondità di 0,6 cm su un trattamento tempo di 4.6 min. Targeting tra diversi ROI sarà necessario calcolare diversi parametri. <ol><li> Se studiare gli effetti della dieta ricca di grassi sulla neurogenesi nel eminenza mediana come descritto in precedenza 2, avere quattro settimane di età C57B femminileL6 / J topi da laboratorio Jackson Mouse, e case di quattro topi per gabbia. Passare cibo da chow normale ad una dieta ricca di grassi a cinque settimane di vita. Consentire topi per acclimatarsi alle nuove abitazioni e cibo. Eseguire il trattamento CFIR a 5,5 settimane di vita. Trasporti sottopone alla sala operatoria che contiene la piattaforma radiologica. Ridurre al minimo i livelli di stress durante il trasferimento. Preparare isoflurane camera di anestesia gassosa. Quindi, aggiungere un singolo mouse nella camera. In parallelo, preparare rilievo di riscaldamento (livello basso) per il post-trattamento. </li><li> Una volta mouse è sotto e non risponde alla compressione piede-pad, portare il soggetto alla piattaforma radiologica e posizionare sul letto immobilizzazione della fase robotico. Posizionare la bocca del soggetto in anestesia tazza naso-cone, e denti nella guardia morso (Figura 1D). Posare il mouse sul letto immobilizzazione e verificare se continua a mantenere insensibilità. Se è così, il nastro fino mouse sul letto con nastro garza. Mentre taping giù il mouse per il letto, Assicurarsi che la testa è livellato ad un piano orizzontale. Questo può essere determinato tirando le orecchie e vedere se sono livellate. Una volta che il mouse è nella posizione corretta, chiudere lo scudo protettivo di piombo. </li><li> Acquisire la scansione del computer-tomografia utilizzando il software a bordo della piattaforma radiologica dello sperimentatore (questo sarà diverso tra le piattaforme), che fornirà un tridimensionale anatomico scansione strutturale del soggetto mouse. Controllare per vedere se la testa del mouse è livellata al piano orizzontale. In caso contrario, ripetere i passaggi 1,2-1,3 fino a quando la testa del soggetto è livellato. </li><li> Identificare ROI per immagine TC. Calcolo della distanza da ROI alla superficie del cranio con un angolo di 45 ° rispetto al piano orizzontale, come mostrato nella Figura 3E. </li><li> Utilizzo del software di bordo, prendere una radiografia del soggetto mouse da sopra, come mostrato in Figura 4A. Quindi, rimuovere il mouse dalla piattaforma radiologica, messo in rilievo di riscaldamento, e monitorare fino attiva. </li><li> Dalle immagini CT coronali, calcolare la profondità media ROI anatomica di almeno tre topi per determinare consegna dosaggio. Come esempio di un precedente studio 2 dove 10 Gy di irradiazione è stato somministrato all&#39;ipotalamo ventrobasal, la profondità della ROI dal cranio (da un angolo di 45 °) è 0,66 centimetri (vedere Figura 3E). Sapendo che, i ricercatori hanno utilizzato il software di pianificazione dose (DPS) installato sulla loro piattaforma radiologica per calcolare la velocità di rotazione e della lunghezza del trattamento per raggiungere il dosaggio desiderato al ROI. </li><li> Dopo aver determinato la durata del trattamento e velocità di rotazione della fase robotico con il software dose-pianificazione, misurare distribuzioni di dose dei parametri calcolati con pellicole sensibili alle radiazioni GAFchromic incorporati in una plastica modello mock-topo equivalente-acqua. Per fare questo, inserire tre film sensibili alle radiazioni GAFchromic tra quattro impilati verticalmente equivalente in acqua blocchi di plastica da 29mostrato nella Figura 4B. </li><li> Posizionare il modello finto topo contenenti film GAFchromic sul palco robotica, ed eseguire il fascio di irradiazione focale con i nuovi parametri calcolati. Ad esempio, per indirizzare la ventrobasal ipotalamo, inserire i parametri da 0,15 mm Filtro Cu, 225 kVp, 13 mA, 1-mm impostazione radiazioni diametro del fascio, 45 ° a portale, 1,3 ° / sec rotazione e 4,6 min per ottenere un ROI la dose radiologica di 10 Gy. </li><li> A seguito di irradiazione, controllare film per modello e l&#39;intensità della dose di radiazioni. Per un angolo di rotazione di 360 ° con i parametri elencati di indirizzare l&#39;ipotalamo ventrobasal, un anello scuro nella pellicola sopra all&#39;isocentro un piccolo punto croccante alla pellicola isocentro, e un anello leggero nel film sotto la isocentro corrispondente al cono- somministrazione fascio di irradiazione sarà osservato (Figura 4B). </li><li> Sovrapporre isocentro pellicola GAFchromic sulle radiografie di soggetti topo da cui i parametri sono stati calcalcolato. Il punto focale irradiato di isocentro dovrebbe sovrapporsi con la regione ROI desiderato come mostrato in figura 4C. </li></ol> Metodo alternativo: se difficoltà di mirare ROI cervello persiste, utilizzare contrasto iodato iniettato intratecale per migliorare la visualizzazione dei ventricoli in immagini CT. Per brevità, questa procedura è lasciato fuori di questo protocollo, ma viene descritto in precedenza 35, 50. Contrasto iodato fornirà punti di riferimento ventricolari supplementari (Figura 5A). 2. Determinare l&#39;accuratezza di irradiazione del fascio Ulteriore conferma CFIR precisione fascio per la visualizzazione diretta del fascio di radiazioni nel tessuto 2, 35, 51. Per fare questo, eseguire immunoistochimica per rilevare γH2AX 51, una proteina istone e un marker precoce di DNA a doppio filamento si rompe. Soggetti mouse deve essere transcardiaca perfusi e fissati entro un&#39;ora di irradiazione. A seguito di irraggiamentoation, riparazione del DNA rapidamente ne deriva, e livelli di ΥH2Ax diminuiscono in modo significativo 35. <ol><li> Ripetere i passaggi 1,1-1,3. </li><li> Dopo che il bersaglio è identificato CT, il soggetto mouse viene spostato sotto controllo robotico per allineare questo obiettivo con il fascio di radiazioni di consegna. Parametri calcolati ingresso (velocità di rotazione e durata del trattamento per raggiungere il dosaggio desiderato) dal punto 1.6 nel software dose di pianificazione e iniziare il trattamento. Il trattamento è fornito con il cavalletto puntato a 45 ° rispetto alla verticale mentre il mouse ruota attorno ad un asse verticale orientato. </li><li> A seguito di irradiazione, eseguire perfusione transcardial su argomenti mouse. Eseguire perfusione entro un&#39;ora 52. A seguito di cervelli perfusione, l&#39;immersione fissi nel 4% PFA / PBS e rock delicatamente notte a 4 ° C. </li><li> La mattina seguente, lavare 5 min in PBS 3x per rimuovere paraformaldeide fissativo. Poi, immergere in 30% saccarosio in PBS 1x su un agitatore a 4 ° C. </li><li> Agitare delicatamente a 4 ° C (usmanualmente 12-16 ore), fino al cervello affonda al fondo della provetta. Questo serve come un passo crioprotezione. Una volta che il cervello lavello, rimuovere il cervello con un cucchiaio forato per evitare che l&#39;eccesso del 30% sucrose/1x trasferimento PBS. Rapidamente incorporare nel congelamento di media in ghiaccio secco. Agitare medie congelamento con puntale e allineare cervello in stampi in plastica. </li><li> Una volta completamente congelato, trasferire i blocchi del cervello a -20 ° C per una conservazione. </li><li> Il giorno in cui verrà effettuata l&#39;immunoistochimica, sezione coronale a 40 micron di spessore, e galleggiare in una piastra a 24 pozzetti contenenti PBS con un pennello sottile. Le sezioni devono essere conservati in modo seriale corretto per immunoistochimica per determinare la copertura irradiazione della regione di destinazione. </li><li> Preriscaldare 0,01 M soluzione di citrato di sodio a 80 ° C a bagnomaria in preparazione per il passaggio recupero dell&#39;antigene. Contemporaneamente, mentre il citrato di sodio si sta riscaldando, eseguire 5 min lavaggi 3x in 0,01 M PBS. </li><li> Una soluzione di citrato di sodio è a 80 ° C, immergere sezioni di cervello in la soluzione tampone di citrato di sodio. Lasciare in bagno d&#39;acqua a 80 ° C per 1 ora. </li><li> Smontare la parte e lasciare soluzione di citrato di sodio a temperatura ambiente, quindi eseguire tre lavaggi di 5 minuti in 0,01 M PBS. </li><li> Bloccare sezioni di cervello per 1 ora in PBS-Triton contenenti siero di capra normale al 5%. </li><li> Incubare le sezioni cerebrali overnight nella PBS-Triton contenenti siero di capra normale 5% con 1:700 concentrazione di topo anticorpo primario anti-fosfo-H2AX a 4 ° C. </li><li> Il giorno dopo, eseguono 15 min lavaggi 3x in 0,01 M PBS-Triton. </li><li> Incubare le sezioni cerebrali PBS-Triton contenente 5% di siero di capra normale di capra anti-topo anticorpo secondario coniugato con 488 nm fluorphore a 1:500 concentrazione per 2 h. </li><li> Eseguire 15 min lavaggi 3x in 0,01 M PBS-Triton. </li><li> Esegui 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) macchia (1:5.000 in PBS) per 10 min per visualizzare nucleo. Poi, lavare sezioni di cervello per 5 minuti con PBS. </li><li> Montare su elettrostaticamente chmicroscopio arged scivola dalla sezione galleggianti in PBS. Pulire l&#39;eccesso di PBS e lasciare i vetrini si asciughino. Coprioggetti i vetrini con mezzo di montaggio e permettono i vetrini si asciughino al buio a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Scatta foto di sezioni coronali seriali con microscopio a fluorescenza. ΥH2Ax immunostaining (verde) indica sito di irradiazione. DAPI (blu) è un colorante nucleare (Figura 5B). </li></ol> 3. Preparazione del mouse Soggetti di irradiazione focale Esaminare i risultati di immunoistochimica ΥH2Ax. Una volta soddisfatti con la calibrazione e la destinazione del fascio di irradiazione, procedere con l&#39;esperimento. A questo punto, il tempo totale necessario per trattare un mouse (da impostazione animale a completamento di consegna fascio) è di circa 10-15 minuti per un trattamento di 10 Gy con un raggio di 1 mm. <ol><li> Ordina quattro settimane di età topi C57BL6 / J femminile dai laboratori Jackson Mouse. Casa di quattro topi per gabbia, e passare il cibo da chow normalea una dieta ricca di grassi a cinque settimane di vita. Topi orecchio pugno per dare loro segni di riconoscimento unici. Monitorare la salute dei topi al giorno. Nota: marcatori metallici non possono essere utilizzati come essi rappresentino striature artefatti sul CT. </li><li> Pesare i topi il giorno prima del trattamento con radiazioni o sham. Topi suddivisi in due coorti per le radiazioni o il trattamento sham e garantire che non vi è alcuna differenza significativa nel peso tra coorti. Il giorno di trattamento, quando i topi sono sei settimane di vita, si ripesa tutti i topi e registrare la loro massa. Trasportare delicatamente entrambe le coorti alla piattaforma radiologica. Fate attenzione a ridurre al minimo i livelli di stress. </li><li> Preparare isoflurane camera di anestesia gassosa. Anestetizzare due topi, uno nel gruppo irradiazione predeterminato, e un altro nel gruppo di controllo sham. Preparare rilievo di riscaldamento impostata sul basso per il trattamento post-operatorio. </li><li> Seguire i passaggi 1,2-1,4 per il mouse a ricevere irradiazione. Per il topo finto, tenere il mouse in camera di anestesia mentre il trattamento è in corso. Fai sure che la camera di anestesia si trova vicino alla piattaforma CFIR così eventuali effetti sulle radiazioni ambientali sono presi in Dopo il bersaglio viene identificato in CT, spostare il mouse soggetto sotto controllo robotico per allineare questo obiettivo con il fascio di radiazioni di consegna. Ingresso parametri (velocità di rotazione e durata del trattamento) calcolato nel software dose-pianificazione. </li><li> Una volta che il trattamento di irradiazione è completo, di ritorno sia sham e topi irradiati al pad di riscaldamento, e monitorare fino a quando si svegliano. </li><li> Rientro sia sham e topi irradiati per stabulario. Controllare ogni giorno. Pesare il mouse ogni metà settimana. Per confermare irradiazione di mirati zona proliferativa ipotalamica, somministrare iniezioni intraperitoneali di BrdU (50 mg / kg), tre giorni dopo il trattamento ed esaminare neurogenesi tra i gruppi per colabeling di immunoistochimica per BrdU e un marcatore neuronale un mese dopo l&#39;esposizione iniziale BrdU (Figura 6) 2. </li></ol>

JW ha un finanziamento della ricerca e consultazione accordi con Xstrahl, Inc.

Irradiazione focale TC-guidata (CFIR) è un approccio nuovo e completo sistema in grado di fornire campi di radiazione a obiettivi nei piccoli animali sotto controllo robotico con CT-guida 32. La capacità di CFIR di fornire fasci altamente mirati per piccoli modelli animali offre nuove opportunità di ricerca per colmare laboratorio di ricerca e traduzione clinica. Questo documento descrive l&#39;approccio CFIR per la consegna di radiazione preciso per indirizzare specificamente una popolazione progenitore n...

Recenti scoperte hanno dimostrato che il cervello dei mammiferi adulti può subire un notevole grado di plasticità. Neuroni nati adulti, vengono generati durante l&#39;età adulta in nicchie specializzate del cervello dei mammiferi 1. Qual è la funzione di questi neuroni adulti nati? E tanto più, non giocano un ruolo nella fisiologia e del comportamento? Studi su questo argomento sono tradizionalmente focalizzati sulla zona subventricular dei ventricoli laterali e la zona subgranulare dell&#39;ippocampo, tuttavia, studi recenti hanno caratterizzato neurogenesi in altre regioni del cervello come l&#39;ipotalamo mammifero 2. Neurogenesi è stata riportata nel postnatale e adulta ipotalamo 2-10, e la funzione di questi neuroni ipotalamici neonati rimane un&#39;area attiva di ricerca. La caratterizzazione funzionale dei neuroni adulti nati rimane una sfida significativa per il campo delle neuroscienze in generale. L&#39;inibizione selettiva di specific popolazioni progenitrici neurali resta limitata dalla mancanza di marcatori molecolari disponibili che sono unici per singole popolazioni progenitrici neurali 11. Così, l&#39;eliminazione selettiva dei neuroni adulti nati da questi progenitori neurali tramite il targeting genetico rimane difficile. Allo stesso modo, la consegna virale di indirizzare neuroni adulti nati soffre di potenziali variabili confondenti quali l&#39;introduzione di lesioni e infiammazioni nell&#39;ambiente 12. Nuovi strumenti radiologici stanno emergendo, tuttavia, che permettono di aggirare queste confonde e indagare queste domande attraverso accurata e precisa di targeting anatomica nei piccoli animali. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita e la differenziazione di nuovi neuroni, e permette un metodo non invasivo per indirizzare le popolazioni progenitrici neurali 13-15. Recentemente, abbiamo descritto una regione germinale dell&#39;eminenza mediana dell&#39;ipotalamo mammiferi (ME) che abbiamo chiamato la zona proliferativa ipotalamico (HPZ) 2 </sup&gt;. Abbiamo scoperto che quando i giovani topi femmina adulti sono stati dati una dieta ricca di grassi (HFD), i livelli di neurogenesi nei topi HFD-alimentati erano nettamente superiori a loro chow normale (NC) controlli alimentati in questa regione ME 2. Per verificare se neurogenesi adulta all&#39;interno della ME ipotalamo regola il metabolismo e il peso, abbiamo cercato di interrompere questo processo. L&#39;eminenza mediana è una piccola struttura unilaterale alla base del terzo ventricolo da cui vengono rilasciati ormoni regolamentazione. Al fine di inibire la proliferazione e la successiva neurogenesi senza alterare le altre funzioni fisiologiche di questa regione del cervello, abbiamo sviluppato una tecnica di irradiazione focale non invasivo per inibire selettivamente la nascita di neuroni adulti appena nati nel eminenza mediana ipotalamico 2. Un certo numero di gruppi hanno impiegato radiazione per sopprimere la neurogenesi nelle regioni canonici 14-28. Tuttavia, gli approcci radiologici precedenti hanno generalmente mirata grandi aree, o often involontariamente preso di mira anche diverse aree cerebrali in cui e &#39;stato segnalato neurogenesi, il che rende difficile associare in modo univoco tutti i difetti comportamentali osservati con difetti in specifiche popolazioni progenitrici neurali. La capacità di irradiazione più mirato è fornito dalle piattaforme radiologiche che combinano c omputer tomografia guidata con radiazioni Ocal f fascio ir (CFIR) la consegna per consentire precisa anatomica di targeting 29-36. Fasci di radiazioni fino a 0,5 mm di diametro sono a disposizione per indirizzare specifiche popolazioni progenitrici neurali 35. Questa metodologia ci permette di indirizzare il ME ipotalamo e l&#39;arresto della proliferazione e blocchiamo la neurogenesi nei piccoli animali. Dopo il trattamento radiologico nelle popolazioni progenitrici, prove funzionali e comportamentali possono essere eseguite per illuminare la funzione potenziale di cellule adulte-nato. Il targeting focale è particolarmente importante per la nostra applicazione in quanto laghiandola pituitaria si trova vicino alla eminenza mediana dell&#39;ipotalamo, irradiazione dell&#39;ipofisi può influenzare la funzione ormonale e successivamente confondere risultati. La base biologica per la soppressione della neurogenesi dopo irradiazione rimane ancora poco chiaro. Gli studi di radiazione precedenti hanno fatto affidamento su grandi travi della zona, e hanno concluso che la soppressione della neurogenesi è mediata da una risposta infiammatoria 14, 37. Come tale non è chiaro se l&#39;irradiazione altamente focale potrebbe sopprimere la neurogenesi, dal momento che non evoca una risposta infiammatoria notevole. Tuttavia, studi recenti nostro gruppo del classico regione neurogenica nell&#39;ippocampo hanno dimostrato che l&#39;irradiazione altamente focale con una dose di 10 Gy può sopprimere neurogenesi per almeno 4 settimane dopo l&#39;irradiazione 35. Per interrogare la funzione di adulti nati neuroni ipotalamici nella eminenza mediana, usiamo una radiazione di precisione device in grado di erogare TC in combinazione con piccolo diametro fasci di radiazioni per inibire ME neurogenesi. L&#39;utilizzo di un tubo a raggi X attaccato ad un cavalletto che ruota in un intervallo di 360 °, trasportiamo arco-Trave micro irradiazione con l&#39;uso di un portaoggetti controllato robot che permette la rotazione di un soggetto animale durante il trattamento con radiazioni (Figura 1) . Un rivelatore di raggi X ad alta risoluzione viene utilizzato per acquisire immagini quando il cavalletto è in posizione orizzontale 33. Per questo studio, immagini CT sono state ricostruite con una dimensione voxel isotropico di 0.20 mm. Bordo TC permesso l&#39;identificazione di un obiettivo, mentre l&#39;animale è in posizione di trattamento. L&#39;obiettivo è stato localizzato utilizzando il software di navigazione CT dose di pianificazione, che era inclusa con il nostro disponibile in commercio piattaforma radiologica. Dopo localizzazione nostro ROI TC, l&#39;animale è stato spostato nella posizione di trattamento appropriato dal portaoggetti robotico che ha quattro gradiRees di libertà (X, Y, Z, θ). Attraverso una combinazione di angoli gantry e stage robot, le travi possono essere forniti da quasi qualsiasi direzione rispetto per l&#39;animale, e trattamenti ad arco-like stereotassica sono possibili 29. Per questi e altri studi di imaging, i topi sono stati posizionati in un dispositivo di immobilizzazione che consente l&#39;erogazione di gas anestetico isoflurano mentre limita il movimento. Il letto immobilizzazione è compatibile CT, e si connette al portaoggetti robotico 34. Ci aspettiamo che CFIR fornirà anticipazioni concettuali in un certo numero di aree di ricerca. Anche se usiamo il targeting radiologica dell&#39;eminenza mediana ipotalamico come prova di principio di questa tecnica, CFIR può essere utilizzato per mirare qualsiasi regione del corpo di qualsiasi piccola organismo modello in linea di principio. Nelle neuroscienze, per esempio, prevediamo questa tecnica può essere utilizzata per valutare la funzione di popolazioni progenitrici attivamente proliferanti che sono state proposte per esit in altri organi circumventricolari, come l&#39;area postrema 38, 39, organo subfornicale 40, e l&#39;ipofisi 41. Controversie di lunga data per quanto riguarda il ruolo funzionale della neurogenesi adulta e che identificano un ruolo causale nel comportamento possono ora essere meglio affrontati. In songbird, questa tecnica potrebbe riguardare il ruolo di neurogenesi nel mantenere il comportamento robusta e stagionale degli uccelli 42, che è stato ostacolato dalla capacità di inibire selettivamente neurogenesi in specifiche regioni cerebrali. La comprensione di questo modello comportamentale robusta potrebbe gettare nuova visione del ruolo della neurogenesi adulta nel regolare altri comportamenti dimorfismo sessuale. In alternativa, nel campo metabolico, CFIR potrebbe essere utilizzato per esplorare aspetti del ruolo di epatociti proliferazione e il suo ruolo nel metabolismo e bilancio energetico. La possibilità di avanzamento concettuale in molteplici discipline di ricerca viene migliorato con l&#39;introduzione di questa tecnica. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; In questo lavoro, abbiamo dimostrato le capacità di CFIR per la precisione anatomica di targeting di un fascio di irradiazione focale. Anche se inizialmente abbiamo sviluppato questa piattaforma di ricerca sulle radiazioni di piccoli animali (SARRP) per i nostri studi, altri dispositivi simili sono ora disponibili in commercio che può compiere simili TC guidata irradiazione focale 43, 44. Quindi, generalizziamo questo protocollo CFIR con passaggi necessari per tutte le piattaforme di ricerca piuttosto che quelli specifici per SARRP. I vantaggi di CFIR oltre approcci radiologici precedenti per inibire neurogenesi sono che questa tecnica permette orientamento immagine volumetrica tridimensionale per la localizzazione e il targeting della dose, la dose conformazionale minimizza l&#39;esposizione di regioni cerebrali nontargeted e geometria della trave alta precisione permette di distribuzione della dose conforme con confini fascio taglienti. Delineiamo come usare l&#39;imaging TC guidata di indirizzare la dose di una regione anatomica specifica e su questo modo, come visualizzare la radiazionedosare la distribuzione direttamente nel tessuto utilizzando colorazione immunoistochimica per γ-H2AX, un marker di DNA a doppio filamento breaks 35, 45-48. L&#39;uso di questo approccio per l&#39;irradiazione selettiva di nicchie neurogena può avere implicazioni significative nel rivelare il ruolo funzionale di nuovi neuroni adulti nati sulla fisiologia e patologia.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP research platform</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td>RS225A</td>
			<td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP irradiation bunker</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td></td>
			<td>Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAF chromic film</td>
			<td>IPS</td>
			<td>GAFchromic ETB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse phantom</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>457</td>
			<td>Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>05-636</td>
			<td>clone JBW301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat rodent diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12492i</td>
			<td>60% of the calories as fat, food should be irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>10019-360-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 M Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vectashield or Gelvatol is preferred</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition

La caratterizzazione funzionale dei neuroni adulti nati rimane una sfida significativa. Approcci per inibire neurogenesi adulta tramite consegna virale invasivo o animali transgenici hanno potenziali confonde che rendono l&#39;interpretazione dei risultati di questi studi difficile. Nuovi strumenti radiologici stanno emergendo, tuttavia, che permettono di indagare in modo non invasivo la funzione di selezionare gruppi di neuroni adulti nati attraverso accurata e precisa di targeting anatomica nei piccoli animali. Radiazioni ionizzanti Focal inibisce la nascita e la differenziazione di nuovi neuroni e consente il targeting di specifiche regioni progenitrici neurali. Per illuminare il potenziale ruolo funzionale che la neurogenesi adulta ipotalamico svolge nella regolazione dei processi fisiologici, abbiamo sviluppato una tecnica di irradiazione focale non invasivo per inibire selettivamente la nascita di neuroni adulti nati nel eminenza mediana dell&#39;ipotalamo. Descriviamo un metodo per C omputer tomografia-guidaf Ocal ir radiazione (CFIR) la consegna per consentire preciso e accurato anatomica di targeting in piccoli animali. CFIR utilizza l&#39;orientamento dell&#39;immagine volumetrica tridimensionale per la localizzazione e il targeting della dose di radiazione, riduce al minimo l&#39;esposizione alle radiazioni regioni cerebrali nontargeted, e consente la distribuzione della dose conforme con i confini del fascio taglienti. Questo protocollo permette di porre domande riguardanti la funzione dei neuroni adulti di nascita, ma apre anche le aree a domande nei settori di radiobiologia, biologia dei tumori, e dell&#39;immunologia. Questi strumenti radiologici faciliteranno la traduzione di scoperte al banco al capezzale.

Valutare Targeting CT-guidata e precisione La taratura meccanica del sistema è fondamentale per garantire che travi da varie angolazioni tutti intersecano in un unico punto. Calibrazione è stata eseguita con un metodo di imaging basata semi-automatico, dove end-to-end precisione di allineamento è stato misurato per essere 0,2 millimetri 29. Questa precisione è molto critica come il volume della struttura eminenza mediana ipotalamico è piccolo 2. Per verificare questa ...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition at JoVE.com

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

La funzione dei neuroni di mammifero adulto-nato rimane un&#39;area attiva di ricerca. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita di nuovi neuroni. Utilizzando la tomografia computerizzata guidata irradiazione focale (CFIR), tridimensionale anatomico di mira specifiche popolazioni progenitrici neurali può ora essere utilizzato per valutare il ruolo funzionale della neurogenesi adulta.

Interrogatorio funzionale di età ipotalamico neurogenesi con focale Radiological inibizione

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

functional-interrogation-adult-hypothalamic-neurogenesis-with-focal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K Views.  California Institute of Technology.  La funzione dei neuroni di mammifero adulto-nato rimane un'area attiva di ricerca. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita di nuovi neuroni. Utilizzando la tomografia computerizzata guidata irradiazione focale (CFIR), tridimensionale anatomico di mira specifiche popolazioni progenitrici neurali può ora essere utilizzato per valutare il ruolo funzionale della neurogenesi adulta. 

Video: Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the processing of simple sensory stimuli. We will use somatosensory stimuli to locate the hand somatosensory areas, auditory stimuli to locate the auditory cortices, visual stimuli in four quadrants of the visual field to locate the early visual areas. These type of experiments are used for functional mapping in epileptic and brain tumor patients to locate eloquent cortices. In basic neuroscience similar experimental protocols are used to study the orchestration of cortical activity. The acquisition protocol includes quality assurance procedures, subject preparation for the combined MEG/EEG study, and acquisition of evoked-response data with somatosensory, auditory, and visual stimuli. We also demonstrate analysis of the data using the equivalent current dipole model and cortically-constrained minimum-norm estimates. Anatomical MRI data are employed in the analysis for visualization and for deriving boundaries of tissue boundaries for forward modeling and cortical location and orientation constraints for the minimum-norm estimates.

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to map brain areas involved in the processing of simple sensory stimuli.

Mappatura funzionale con EEG e MEG simultaneo

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Ricerca

Neuroscienze

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imaging funzionale di Auditory Cortex in gatti adulti utilizzando ad alto campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La valutazione primaria neurogenesi in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrioni Utilizzando Immunocolorazione

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Online Transcranial Magnetic Stimulation Protocol for Measuring Cortical Physiology Associated with Response Inhibition

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) characterization of primary motor cortex (M1) excitability and inhibition. Motor response inhibition prevents unwanted actions and is abnormal in several neuropsychiatric conditions. TMS is a non-invasive technology that can quantify M1 excitability and inhibition using single- and paired-pulse protocols and can be precisely timed to study cortical physiology with high temporal resolution. We modified the original Slater-Hammel (S-H) stop signal task to create a &#34;racecar&#34; version with TMS pulses time-locked to intra-trial events. This task is self-paced, with each trial initiating after a button push to move the racecar towards the 800 ms target. GO trials require a finger-lift to stop the racecar just before this target. Interspersed randomly are STOP trials (25%) during which the dynamically adjusted stop signal prompts subjects to prevent finger-lift. For GO trials, TMS pulses were delivered at 650 ms after trial onset; whereas, for STOP trials, the TMS pulses occurred 150 ms after the stop signal. The timings of the TMS pulses were decided based on electroencephalography (EEG) studies showing event-related changes in these time ranges during stop signal tasks. This task was studied in 3 blocks at two study sites (n=38) and we recorded behavioral performance and event-related motor-evoked potentials (MEP). Regression modelling was used to analyze MEP amplitudes using age as a covariate with multiple independent variables (sex, study site, block, TMS pulse condition [single- vs. paired-pulse], trial condition [GO, successful STOP, failed STOP]). The analysis showed that TMS pulse condition (p&#60;0.0001) and its interaction with trial condition (p=0.009) were significant. Future applications for this online S-H/TMS paradigm include the addition of simultaneous EEG acquisition to measure TMS-evoked EEG potentials. A potential limitation is that in children, the TMS pulse sound could&#160;affect behavioral task performance.

We describe an experimental procedure to quantify excitability and inhibition of primary motor cortex during a motor response inhibition task by using Transcranial Magnetic Stimulation throughout the course of a Stop Signal Task.

Protocollo di stimolazione magnetica transcranica online per misurare la fisiologia corticale associata con l'inibizione di risposta

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) ...