Per iniziare, lavare gli scaffold di mele decellularizzate con soluzione salina tamponata con fosfato. Per le misurazioni della dimensione dei pori, incubare gli scaffold in un millilitro di soluzione bianca al 10% di calcofluor per 25 minuti al buio a temperatura ambiente. Dopo aver lavato gli scaffold con PBS, utilizzare un microscopio a scansione laser confocale risonante ad alta velocità e impostare la configurazione del filtro di emissione laser.
Regolare manualmente la potenza del laser e il rilevatore per garantire un'acquisizione ottimale dell'immagine. Acquisisci uno stack Z di 20 immagini con un passo di cinque micrometri. Successivamente, nel software ImageJ, utilizzare la funzione di proiezione Z alla massima intensità per creare un'immagine e applicare la funzione Trova bordi per evidenziare il bordo dei pori.
Traccia manualmente i pori utilizzando lo strumento di selezione a mano libera. Adatta ogni poro come un'ellisse e misura la lunghezza dell'asse maggiore. Compila tutte le misure e calcola la lunghezza media.
Per l'analisi della distribuzione cellulare, dopo aver lavato tre volte con PBS gli scaffold seminati con semi cellulari coltivati nel terreno appropriato con PBS, fissarli con paraformaldeide al 4% per 10 minuti. Quindi lavare accuratamente ogni scaffold con acqua deionizzata, permeabilizzare le cellule con una soluzione Triton X-100 per cinque minuti e lavare di nuovo con PBS. Incubare gli scaffold in un millilitro di acido periodico all'1% per 40 minuti e risciacquare con acqua deionizzata.
Quindi incubare gli scaffold immergendoli completamente in un millilitro di soluzione colorante. Lavare gli scaffold con PBS e colorare i nuclei cellulari incubando gli scaffold in una soluzione DAPI da cinque milligrammi per millilitro per 10 minuti al buio. Lavare accuratamente di nuovo e conservare le impalcature in PBS.
Fotografare gli scaffold seminati con cellule con un microscopio a scansione laser confocale risonante ad alta velocità con un ingrandimento 10X utilizzando le impostazioni mostrate qui. Regolare manualmente la potenza del laser e il rilevatore per garantire un'acquisizione ottimale delle immagini e acquisire una pila Z di 20 immagini con un passo di cinque micrometri. Quindi utilizzare il software ImageJ per elaborare le immagini confocali e utilizzare la funzione di proiezione Z alla massima intensità per creare una proiezione massima nell'asse z per l'analisi dell'immagine.
La quantificazione delle immagini al microscopio confocale ha dimostrato una distribuzione delle dimensioni dei pori compresa tra 73 e 288 micrometri, con una media di circa 154 micrometri. La maggior parte dei pori variava tra 100 e 200 micrometri. Dopo la coltura nel mezzo di differenziazione, sono stati osservati depositi minerali nelle impalcature.
Gli scaffold con semi cellulari mostravano una colorazione bianca opaca che suggeriva una mineralizzazione, che non è stata osservata negli scaffold vuoti. Inoltre, l'analisi al microscopio a scansione laser confocale ha rivelato una distribuzione cellulare omogenea all'interno degli scaffold.
