Per il saggio della fosfatasi alcalina e i saggi di deposizione di calcio, iniziare lavando tre volte con PBS gli scaffold derivati da mele con semi cellulari coltivati nel terreno appropriato con PBS. Fissare gli scaffold con formalina tamponata neutra al 10% per 30 minuti. Per il dosaggio della fosfatasi alcalina, preparare la soluzione colorante BCIP/NBT sciogliendo una compressa BCIP/NBT in 10 millilitri di acqua deionizzata.
Quindi, lavare gli scaffold fissi con una soluzione TWEEN allo 0,05% e colorare con la soluzione BCIP/NBT per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare le impalcature con una soluzione TWEEN allo 0,05% e conservarle in PBS. Quindi, riprendi le impalcature macchiate con una fotocamera digitale da 12 megapixel.
Per il saggio di deposizione di calcio, preparare la soluzione colorante Alizarin Red S al 2% in peso in volume. Quindi, lavare gli scaffold fissi con acqua deionizzata e colorarli con la soluzione Alizarin Red S per un'ora a temperatura ambiente. Lavare gli scaffold macchiati con acqua deionizzata e conservarli in PBS prima dell'imaging.
Immagine con una fotocamera digitale da 12 megapixel. Per eseguire le misurazioni del modulo di Young, rimuovere gli scaffold con semina cellulare dal rispettivo mezzo di incubazione e testare immediatamente i campioni utilizzando un apparato di compressione uniassiale costruito su misura dotato di una cella di carico da 1,5 newton. Comprimere le impalcature a una velocità costante di tre millimetri al minuto fino a una deformazione di compressione massima del 10% dell'altezza dell'impalcatura.
Determinare il modulo di Young dalla pendenza della parte lineare delle curve di sollecitazione/deformazione. La colorazione BCIP/NBT ha rivelato un aumento sostanziale dell'attività della fosfatasi alcalina negli scaffold a seme cellulare coltivati nel terreno di differenziazione rispetto agli scaffold in cella di coltura in bianco o in non differenziazione. Risultati simili sono stati ottenuti per la colorazione Alizarin Red S, indicando una maggiore mineralizzazione del calcio negli scaffold seminati nelle cellule coltivate nel terreno di differenziazione.
Il modulo di Young degli scaffold seminati in cellule coltivati in terreno di differenziazione era di circa 192,0 kilopascal, che era significativamente più alto rispetto agli scaffold con semi cellulari di coltura in bianco o in mezzo di non differenziazione, indicando una maggiore rigidità.
