Per iniziare, usa un'affettatrice a mandolina per tagliare le mele McIntosh in fette spesse otto millimetri. Tagliare il tessuto di ipanzio delle fette di mela in quadrati di cinque per cinque millimetri. Posizionare i campioni quadrati in SDS allo 0,1% per due giorni per decellularizzarli.
Dopo l'incubazione, lavare i campioni con acqua deionizzata e incubarli per una notte in cloruro di calcio 100 millimolari a temperatura ambiente. Quindi sterilizzare questi scaffold in etanolo al 70% per 30 minuti. Lavarli con acqua deionizzata e metterli in una piastra di coltura a 24 pozzetti.
Per la semina cellulare, utilizzare il subclone MC3T3-E1 4 cellule mantenute in piastre trattate con colture cellulari di 10 centimetri di diametro in condizioni di coltura cellulare. Preparare anche un terreno di coltura cellulare composto da alfa MEM integrato con il 10% di siero fetale bovino o FBS e l'1% di penicillina in streptomicina. Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, staccarle dalle piastre di coltura mediante tripsinizzazione.
Centrifugare la sospensione cellulare a 200 g per tre minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in alfa MEM. Successivamente, pipettare un'aliquota di 40 microlitri di sospensione cellulare sulla superficie degli scaffold e lasciare che le cellule aderiscano per un'ora in condizioni di coltura cellulare.
Successivamente, aggiungere due millilitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto di coltura. Rifornire il terreno di coltura ogni due o tre giorni per 14 giorni. Dopo 14 giorni, preparare il terreno di differenziazione aggiungendo 50 microgrammi per millilitro di acido ascorbico e quattro millimolari di fosfato di sodio al terreno di coltura cellulare.
Aggiungere questo terreno al piatto di coltura. Incubare gli scaffold per quattro settimane per indurre la differenziazione delle cellule MC3T3-E1 e reintegrare il terreno ogni tre o quattro giorni.
