Per iniziare, trasfettare le cellule dell'adenocarcinoma dello stomaco con TMEM200A Si-RNA e incubare per due giorni. Quindi, scartare il terreno di coltura cellulare dai pozzetti e lavare delicatamente le cellule due volte con un millilitro di PBS. Mettere le cellule su ghiaccio e aggiungere 150 microlitri di tampone di lisi per il saggio di precipitazione radioimmune preraffreddato.
Utilizzando un raschietto per cellule di plastica, staccare con cautela le cellule aderenti dalla piastra e trasferire delicatamente la soluzione cellulare in una provetta per microcentrifuga preraffreddata. Quindi, centrifugare il lisato cellulare a 1,5 per 10 sollevato alla potenza di quattro G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine BCA, determinare il contenuto proteico seguendo le istruzioni del produttore.
Caricare 30 grammi di proteine da ogni campione su un gel SDS-PAGE al 10%. Far scorrere il gel a 80 volt per 0,5 ore, seguito da 1,5 ore a 120 volt. Successivamente, trasferire le proteine dal gel a una membrana in PVDF da 45 micrometri a una corrente costante di 300 milliampere per 1-1,5 ore.
Posizionare la membrana in PVDF su uno shaker per tre cicli di cinque minuti ciascuno. Dopo aver agitato, aggiungere TBST al contenitore con il lato proteico rivolto verso l'alto. Posizionare la membrana nel tampone bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente.
Lavare la membrana con TBST per tre cicli di 10 minuti ciascuno. Incubare la membrana con gli anticorpi primari per una notte a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato la membrana tre volte con TBST, aggiungere un anticorpo secondario di coniglio o topo e incubare per un'ora a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere il substrato ECL alla membrana PVDF per 30 secondi e rilevare il segnale utilizzando un sistema di imaging. L'efficienza di TMEM200A è stata significativamente ridotta nelle cellule di cancro gastrico HGC-27 trasfettate con Si-RNA, rispetto alle cellule non trasfettate. Il Si-RNA TMEM200A ha inibito significativamente le proteine correlate nella transizione mesenchimale epiteliale e ha influenzato la fosforilazione di AKT nella via di segnalazione della fosfoinositide 3-chinasi.
