Per iniziare, preparare una piastra di agarosio all'1,8% con HEPES Buffered E3 medium o E3. Mentre si lavora al microscopio da dissezione, posizionare da sei a 10 larve anestetizzate in fila sulla piastra di agarosio. Metti uno spillo per insetti sulla testa di ogni larva. Quindi rimuovere l'E3 rimanente dalla piastra utilizzando un fazzoletto.
Usando un altro spillo per insetti, isola l'intestino da una larva senza disturbare gli altri organi. Assicurarsi che il tuorlo venga rimosso correttamente. Una volta isolato, ispezionare l'intestino e rimuovere tutto il materiale non intestinale, come pelle, grasso o fegato.
Utilizzare una pinzetta per raccogliere l'intestino e trasferirlo in PBS contenente il 10% di FCS in una provetta per microcentrifuga posta su ghiaccio. Subito dopo la dissezione di tutti gli intestini, centrifugare la provetta della microcentrifuga a 13.800 g per 30 secondi. Rimuovere il surnatante, lasciando circa 100 microlitri nella provetta per evitare che l'intestino si secchi.
Aggiungere 500 microlitri di soluzione di papaina all'intestino nella provetta. Attiva la papaina aggiungendo 2,5 microlitri di cisteina molare. Quindi incubare la provetta contenente l'intestino a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Pipettare il contenuto su e giù a metà dopo cinque minuti per stimolare la digestione enzimatica dei tessuti. Trasferire le cellule dissociate in una provetta di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, o FACS, attraverso un filtro cellulare da 35 micron pre-sposato. Lavare più volte il filtro aggiungendo 0.5 millilitri di PBS contenente il 10% di FCS a un volume di lavaggio totale di due millilitri.
Centrifugare il filtrato raccolto a 700 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Aggiungere un microgrammo per millilitro di DAPI a 300 microlitri di PBS contenente il 10% di FCS. Aggiungere questa miscela al pellet e risospendere per etichettare le cellule morte.
Quindi incubare per cinque minuti su ghiaccio per consentire la loro esclusione durante la successiva analisi FACS.
