Per iniziare, posizionare il tessuto di topo sezionato in un terreno di coltura cellulare freddo contenente il 5% di FBS. Usando forbici da dissezione affilate, tritare il tessuto fino a ottenere frammenti di circa cinque millimetri. Trasferire i frammenti tritati in una provetta a C e aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare.
Caricare il tubo a C sul dispositivo motorizzato e montare la piastra portatubo sul fondo del tubo a forma di D. Agganciare i bracci di tensione alla piastra acrilica per fissare i tubi alla piastra del motore. Per impostare un programma personalizzato sul dispositivo motorizzato dal menu principale, premere il pulsante blu per scegliere la modalità personalizzata.
Nel primo menu della modalità personalizzata, premere il pulsante verde per specificare la durata della rotazione in avanti a 30 secondi. Quindi premere il pulsante blu per selezionare il valore sullo schermo. Nel secondo menu della modalità personalizzata, premere il pulsante verde per specificare la durata della rotazione inversa a 10 secondi.
Quindi premere il pulsante blu per selezionare il valore sullo schermo. Nel terzo menu della modalità personalizzata, premere il pulsante rosso per specificare i cicli di selezione su quattro volte. Quindi premere il pulsante blu per selezionare il valore sullo schermo.
Regolare la manopola di controllo della tensione su 200 giri/min e avviare il programma personalizzato. Successivamente, aggiungere l'enzima di digestione in quattro millilitri di terreno di coltura a freddo contenente tessuti sezionati. Ancora una volta, caricare il tubo a C sul dispositivo e ripetere il programma personalizzato come dimostrato in precedenza.
Dopo la corsa, trasferire il dispositivo con i tubi caricati in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Quindi, caricare il tubo a C sul dispositivo e impostare il programma personalizzato a 50 giri/min con rotazione in avanti a 270 secondi. Rotazione inversa a 30 secondi e ciclo nove volte.
Aggiungere l'EDTA a una concentrazione finale di cinque millimolari sul campione. Impostare il programma personalizzato a 100 giri/min con rotazione in avanti a 30 secondi. Invertire la rotazione a 10 secondi e ripetere due volte.
Successivamente, far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri e raccogliere il filtrato in un tubo da 50 o 15 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare raccolta a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per un minuto.
Neutralizzare il tampone di lisi con nove millilitri di PBS freddo. Anche in questo caso, centrifugare le celle e risospendere il pellet nel tampone o nel terreno desiderato. La sospensione cellulare preparata con dispositivo motorizzato e dissociazione manuale ha mostrato vitalità cellulare e rese comparabili nei tessuti polmonari, renali e cardiaci del topo.
Le popolazioni di cellule immunitarie come le cellule T e le cellule dendritiche non sono state influenzate in modo significativo dal protocollo di isolamento. L'espressione dei marcatori di superficie ha anche mostrato frequenze simili di cellule T isolate nell'intensità media di fluorescenza per il marcatore di presentazione dell'antigene MHC II nelle cellule dendritiche tra l'isolamento manuale e quello del dispositivo.
