Il protocollo di dissociazione del tessuto pancreatico dimostrato è semplice e fornisce uno strumento per isolare singole cellule vitali dal tessuto pancreatico in diverse fasi del processo di malignità, compresi i tumori solidi. Il recupero di cellule acinose intatte e vitali è una sfida importante. Il protocollo è in grado di recuperare singole cellule vitali da pancreata normale, pancreata con lesioni pre-maligne o tumori pancreatici contenenti numerose cellule stromali e immunitarie.
L'uso di questo protocollo per sezionare i tumori del pancreas umano o il pancreas infiammato potrebbe aiutare a studiare queste malattie per trovare nuovi biomarcatori e trattamenti. Il metodo è facile da usare e può fornire i risultati desiderati con una pratica minima. Questo video aiuterà a visualizzare i piccoli dettagli del protocollo.
Prima di iniziare la dissezione, tenere tutti gli strumenti e le attrezzature pronti sul ghiaccio. Dopo aver riparato il topo soppresso, spruzzare il suo addome con etanolo al 70%. Usando forbici e pinze, praticare un'incisione a forma di V di 2,5 centimetri nell'area genitale dell'animale e procedere verso l'alto per aprire completamente la cavità addominale.
Individua lo stomaco sul lato sinistro del topo e il pancreas, che si trova vicino alla milza. Usando due pinze, separare il pancreas dallo stomaco e dal duodeno senza strapparlo. Continuare e separare il pancreas dall'intestino tenue, dal digiuno e dall'ileo.
Spostare il pancreas sul lato destro e separare le connessioni rimanenti tra il pancreas e la cavità toracica con una pinza per staccare completamente il pancreas e la milza attaccata. Rimuovere con cautela il pancreas senza grasso mesenterico o altro tessuto adiacente e stenderlo per l'esame in una capsula di Petri con ghiaccio. Seguendo la composizione menzionata nel testo, preparare in anticipo i tamponi di dissociazione 1 e 2, lavare il tampone e la soluzione di arresto dell'attività enzimatica.
Mettere il pancreas in un tubo da 50 millilitri su ghiaccio e sciacquarlo con siero bovino fetale al 10%, o FBS, e Hank's Balanced Salt Solution, o HBSS. Il grasso galleggerà e il pancreas affonderà. Questo è un modo semplice per visualizzare e rimuovere rapidamente il tessuto adiposo bianco contaminante ancora attaccato al pancreas.
Successivamente, trasferire e mantenere il tessuto pancreatico del topo in una capsula di Petri sterile contenente cinque millilitri di HBSS su ghiaccio fino al taglio. Usando le forbici Noyes e un bisturi, taglia il pancreas in piccoli pezzi da uno a tre millimetri cubi. Dopo aver trasferito i tessuti in una provetta da centrifuga, centrifugarla a 350 G e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Aspirare e scartare il surnatante per rimuovere i frammenti cellulari e le cellule del sangue. Risospendere sospendere i pezzi nel tampone di dissociazione 1 contenente 0,02%tripsina-C e 0,05%EDTA per 10 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione. Lavare immediatamente con 10%FBS e Dulbecco's Modified Eagle's Medium, o DMEM, e centrifugare per cinque minuti a 350 G e quattro gradi Celsius.
Lavare nuovamente risospendendo il pellet in 10 millilitri di tampone di lavaggio e centrifugando come precedentemente per cinque minuti prima della successiva fase di dissociazione. Incubare il pancreas nel tampone di dissociazione 2 per 15 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 rotazioni al minuto. Dopo 15 minuti, eseguire la dissociazione meccanica pipettando vigorosamente i frammenti pancreatici su e giù per 10 volte utilizzando pipette sierologiche sterili.
Ripetere l'operazione utilizzando pipette di dimensioni decrescenti, a partire da 25, 10 e 5 millilitri. Incubare il campione per portarlo a 37 gradi Celsius. Utilizzare la microscopia ottica per monitorare la dissociazione in base alla quantità di singola cellula nella sospensione.
Monitora la vitalità cellulare utilizzando il blu di tripano. Continuare l'incubazione e controllare la dissociazione prelevando campioni ogni cinque minuti. Incubare fino a quando il 90% delle cellule viene separato in singole cellule.
Dopo che il tessuto pancreatico è ben dissociato, indicato dalla scomparsa dei frammenti pancreatici e dall'aumento della torbidità della soluzione, arrestare la reazione enzimatica lavando due volte con la soluzione di arresto dell'attività enzimatica per cinque minuti a quattro gradi Celsius. A partire da questo passaggio, mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio. Far passare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 70 micron.
Una maglia di nylon più piccola può ridurre la vitalità cellulare. Controllare la vitalità cellulare al microscopio. Risospendere e lavare il pellet con 5-10 millilitri di soluzione di lavaggio tamponata ghiacciata prima di contare le cellule.
Se si osservano diversi globuli rossi, trattare le cellule con un tampone di lisi dei globuli rossi per due minuti a temperatura ambiente. Nei casi in cui si osservano grumi, i campioni devono essere trattati nuovamente con tripsina, come descritto in precedenza. Se la vitalità è inferiore all'80%, le cellule vive devono essere isolate utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente o il kit di rimozione delle cellule morte MACS con colonne MACS MS.
Il colore rosso del tessuto pancreatico isolato è il risultato dell'espressione di tdTomato nelle cellule acinari. In una fase iniziale della dissociazione, c'era un basso numero di cellule isolate e un gran numero di grumi. Successivamente, sono state ottenute cellule vitali isolate evitando di ridurre il numero di cellule vitali.
Un'incubazione più lunga ha ridotto la vitalità delle cellule. Le cellule tdTomato positive sono state stimate utilizzando l'ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza. Il protocollo di dissociazione delicata ha supportato il recupero di più tipi di cellule, con un'elevata vitalità che ha permesso di seguire la selezione cellulare dei tipi di cellule desiderati.
Il conteggio da cellula viva a cellula morta è stato effettuato utilizzando un ematotometro. Le immagini di fluorescenza delle sezioni pancreatiche congelate hanno mostrato le cellule acinose tdTomato positive. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha confermato il rilevamento di tutti i tipi di cellule rilevate nell'ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza in ciascun tessuto resecato da tutti i punti temporali.
È stata studiata l'espressione della carbossipeptidasi1 o CPA1 nelle cellule acinari, indicando una contaminazione minima con il trascrittoma di altri tipi di cellule. È importante notare che tempi di incubazione più lunghi hanno ridotto la vitalità delle cellule, quindi è importante monitorare il campione e osservare la dissociazione del tessuto e la vitalità cellulare ogni pochi minuti al microscopio. Il protocollo di isolamento cellulare può essere utilizzato per il sequenziamento dell'RNA di una singola cellula, per la coltura di cellule o come materiale di partenza per organoidi.
Questa tecnica consente di esplorare come si sviluppa il cancro al pancreas e di studiare le interazioni tra le cellule che si infiltrano nel tessuto infiammato o canceroso.
