L&#39;assistenza tecnica in grado di Anthony Thomas Si ringrazia.

Procedura per l&#39;elaborazione campioni di urina <ol><li> Scongelare il campione di urina in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Decantare in un nuovo contenitore se l&#39;originale è compromessa. </li><li> Prendete un aliquota massima di 13 ml di campione e conservarlo a -20 ° C in una provetta per centrifuga coniche. </li><li> Misurare e registrare la densità ottica del campione mettendo un paio di gocce di urina nel rifrattometro. </li><li> Filtrare il campione attraverso un filtro da 0,2 um. </li><li> Misurare il volume del campione al di sotto in base alla densità ottica <table border="0"><tbody><tr><td> 1,000-1,009 </td><td> 1,00 ml </td></tr><tr><td> 1,010-1,019 </td><td> 0,50 ml </td></tr><tr><td> 1,020-1,050 </td><td> 0,25 ml + 0,25 ml di H 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> Il volume specificato non è poi trasferito in un Reactivial contenente le seguenti norme interne: 500 nanomoli (nmoli) 3 Creatina, 10 nmoli d 3 acido metilmalonico, 100 nmoli ciascuno dei seguenti 13 C 3 lattato, 13 C 3 piruvato, 13 C 2 15 N glicina, serina d 3, d 5 fenilalanina, D 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotato, d 4 acido sebacico, 13 C 6 glucosio, d 6 inositolo e d 5 triptofano. </li><li> 20 microlitri (microlitri) di un 7,5 Unità / ul di soluzione di ureasi (Calzyme catalogo Laboratori no. 116A0100) viene aggiunto al campione, che viene poi lavata e sigillato in CO 2 attraverso un setto inerte. </li><li> Il campione è a 37 ° C per 30 minuti con il gas di biossido di carbonio aggiunto a intervalli di 15 minuti per mantenere la pressione. </li><li> 20 l più della soluzione di ureasi si aggiunge, il flacone viene lavata con l&#39;anidride carbonica, e il campione mantenuto a 37 ° C per altri 15 minuti. </li><li> 500 ml di acetone 30:70: metanolo viene aggiunto, il setto di gomma viene sostituito con un setto rivestito in teflon, e il campione viene raffreddato a -20 ° C per 15 minuti. </li><li> Solidi vengono rimossi mediante centrifugazione a 1500 rpm x 10 minuti, poi travasata in un ambiente pulito 2,0 cc Reactivial (Supelco / Sigma) </li><li> Aggiungi trifluoroacetato triethylammonium (TEA / TFA) (Sigma) come segue: <ul><li> 20 l per 1,00 ml campioni </li><li> 40 microlitri per 0,5 ml, o meno, i campioni </li></ul></li><li> Top fuori con acetonitrile e di luogo in un flusso di azoto a 70 ° C fino a volume costante si ottiene (TEA / TFA rimarrà) (~ 15 minuti). </li><li> Ripetere il passaggio 13, fino a 4 volte fino a quando si forma un precipitato (~ 10 minuti ciascuno). </li><li> Lasciate raffreddare per circa 2 minuti. Top fuori con cloruro di metilene, facendo attenzione di ebollizione, e secco (~ 4:00 minuti). </li><li> Ripetere il punto 15. </li><li> Aggiungi MSTFA (N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (termica scientifico) alle seguenti tariffe: <ul><li> 150 microlitri per 1,00 ml campioni </li><li> 200 ul per 0,50 ml, o meno, i campioni </li></ul></li><li> Cap in atmosfera di azoto e incubare a 70 ° C per 1 ora. </li><li> Trasferimento a microprovette, in atmosfera di azoto, per l&#39;analisi dei gas cromatografo / spettrometro di massa. </li><li> Microprovette posto per l&#39;iniezione automatizzato dal 5975 Agilent GC / MS: le temperature dello strumento sono: iniettore 200 ° C, l&#39;interfaccia di 250 ° C, forno a 80 ° C per 1 minuto; rampa a 4 ° C / minuto 80-130 ° C, rampa 6 ° C / minuto 130-200 ° C, rampa a 12 ° C / minuto 200-285 ° C, mantenere per 10 minuti. Colonna: 25 m, 320 micron ID, spessore 0.5 micron DB-5. Mass Spec: fonte 230 ° C, quad 150 ° C, Scansione 50-650 amu a 2,46 scansioni / sec. Solvente pausa di 3,5 minuti. </li></ol> Rappresentante Risultati Si prega di <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">cliccare qui</a> per vedere i risultati rappresentativi.

<ol>
	<li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates,+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease.">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li><li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease.">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li><li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC/MS+and+dried+urine+filter+paper:+a+study+on+neonatal+mass+screening.">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li><li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects.">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li><li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine,+urease+treatment,+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry.">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li><li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1,6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease/direct+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode.">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li><li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment,+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry.">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li><li>Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+Extension+of+the+Urease+Method+for+Urine+Organic+and+Amino+Acid+Analysis.">Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis.</a> , (2008).</li><li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns.">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li><li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Importance+of+NADP+-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans.">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li><li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading.">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li><li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins:+A+Case+Report.">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li><li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes.">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li><li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies.">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li><li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid.">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li></ol>

Il Laboratorio di Screening metabolica è una CLIA con licenza laboratori clinici di proprietà della Saint Louis University, un&#39;organizzazione non-profit. Dr. Shoemaker non un beneficio diretto dal fatturato di laboratorio, ma può beneficiare indirettamente la produttività del laboratorio. Nessuno dei metodi, tecniche, risultati, gamma normale, macro, il software, le librerie o le conclusioni sono considerati di proprietà e sono liberamente a disposizione degli interessati.

Il metodo di ureasi (1) è stato citato 62 volte nella letteratura medica con varie modifiche. Gruppo di Matsumoto (2,3) ha semplificato la procedura per l&#39;high-throughput screening neonatale e riportato i risultati da 16000 pazienti. Kuhara e altri (4-7) hanno riportato l&#39;utilizzo del metodo in diversi casi di diagnosi degli errori congeniti e follow-up. Rhead (8) ha confermato l&#39;utilità del metodo per la diagnosi clinica e follow-up di errori congeniti. Il metodo è stato applicato a urina di orsi, topi knock-out, elefanti e omogenati di mosche frutti interi e le loro larve (9). Terreni di coltura da Cryptococcus prima e dopo la mutagenesi sito-diretta sono stati analizzati, senza il passaggio ureasi (10). Il metodo è stato applicato per la valutazione dei nutrizionale studenti di medicina, pazienti con sindrome di Down e anziani dementi veterani dopo aver caricato i soggetti con dosi orali degli aminoacidi triptofano, metionina ed isoleucina (11). Tutti gli otto vitamine del gruppo B sono stati valutati da quantificare il prodotti di degradazione dei tre aminoacidi che, tra i quali, che tutte le 8 vitamine ad un certo punto della loro degradazione. Gli effetti tossici dei farmaci e la loro mitigazione da supplementazione di vitamina è stata riportata (12). Campioni di liquido amniotico da gravidanze normali e sindrome di Down sono stati analizzati e riportati (13-15).

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MSD 5975</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GC/MS/Computer</td>
</tr>
<tr>
<td>MSD 5973</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GC/MS/Computer</td>
</tr>
<tr>
<td>Urease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calzyme</td>
<td>116A0100</td>
<td>Also Sigma C3</td>
</tr>
<tr>
<td>Stable Isotope Standards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CDN Isotopes, Isotec, Cambridge Isotope Lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Solvents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Analytes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, Universidad Autonoma de Madrid, Ernesto Brunet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GC Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J&amp;W Scientific</td>
<td>123-5026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEA/TFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka/Sigma</td>
<td>09747</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supelco/Sigma</td>
<td>Z115088/12EA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Merlin Microseal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5181-8815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MSTFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermal Scientific</td>
<td>48913</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

one-step metabolomics: carbohydrates, organic and amino acids quantified in a single procedure

Ogni bambino nato negli Stati Uniti è ora proiettato fino a 42 malattie rare genetiche chiamate &quot;errori congeniti del metabolismo&quot;. Il metodo di screening si basa sulla spettrometria di massa tandem e quantifica acilcarnitine come schermo per acidemias organici e misure anche aminoacidi. Tutti gli stati anche eseguire il test enzimatico per i disturbi di carboidrati come la galattosemia. Perché i risultati possono essere non specifici, test di follow-up dei risultati positivi è necessario utilizzare un metodo più definitiva. La presente relazione descrive il metodo &quot;ureasi&quot; di preparazione dei campioni per lo screening errore congenito. Enzima ureasi cristallino è utilizzato per rimuovere l&#39;urea da fluidi corporei che permette maggior parte degli altri metaboliti solubili in acqua da disidratare e derivatizzati per gascromatografia in un unico procedimento. Disidratazione per evaporazione in corrente di azoto è facilitato con l&#39;aggiunta di acetonitrile e cloruro di metilene. Poi, trimethylsilylation avviene in presenza di un unico catalizzatore, trifluoroacetato triethylammonium. Iniezione automatizzato e cromatografia è seguito da macro-driven quantificazione usanza di 192 metaboliti e semi-quantificazione di ogni componente principale utilizzando librerie specializzate di spettri di massa di TMS derivatizzati composti biologici. L&#39;analisi può essere eseguita sul ampiamente utilizzato piattaforma Chemstation utilizzando le macro e librerie disponibili da parte dell&#39;autore. Nel nostro laboratorio, oltre 16.000 campioni di pazienti sono stati analizzati utilizzando il metodo con una resa diagnostica di circa il 17% - vale a dire il 17% dei campioni risultati rivelano che i risultati dovrebbero essere attuate da parte del medico di ordinazione. Inclusi in queste oltre 180 sono gli errori confermata congeniti, di cui circa il 38% non avrebbe potuto essere diagnosticata con metodi precedenti.

Watch this Scientific Journal Video about One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure at JoVE.com

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Il metodo ureasi di preparazione dei campioni per GC / MS dei metaboliti di intermediazione è presentato dal suo inventore. Il metodo permette di one-step di follow-up di screening neonatale per errori congeniti mediante spettrometria di massa tandem dai carboidrati quantificazione, organici e aminoacidi tutti in un unico processo.

One-step Metabolomica: carboidrati, acidi organici e aminoacidi quantificati in una procedura unica

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

one-step-metabolomics-carbohydrates-organic-amino-acids-quantified

Research

JoVE Journal

Biology

13.0K Views.  Saint Louis University School of Medicine. Il metodo ureasi di preparazione dei campioni per GC / MS dei metaboliti di intermediazione è presentato dal suo inventore. Il metodo permette di one-step di follow-up di screening neonatale per errori congeniti mediante spettrometria di massa tandem dai carboidrati quantificazione, organici e aminoacidi tutti in un unico processo.