Questo protocollo ha molti vantaggi rispetto alla metabolomica del lievito attualmente utilizzata perché ha un'elevata specificità, un'alta sensibilità e può anche profilare molte diverse classi di metaboliti, tra cui molecole isomeriche, isobariche, idrofile e idrofobiche. Il metodo di tempra utilizzato in questo protocollo blocca tutte le reazioni enzimatiche mentre riduce significativamente la perdita di metaboliti dalle cellule. La libreria MS1 integrata in questo protocollo proviene dalle varie esecuzioni MS2.
Dopo la coltura notturna a 30 gradi Celsius e 200 giri al minuto, determinare il numero di cellule di lievito per millilitro di coltura e aggiungere cinque millilitri di soluzione madre sterilizzata al 20% di glucosio a ciascuno dei due palloni Erlenmeyer contenenti 45 millilitri di YP medio autoclavato per pallone. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per aggiungere cinque volte 10 alle settimi cellule di lievito a ciascun pallone e far crescere le cellule di lievito per almeno altre 24 ore a 30 gradi Celsius a 200 giri al minuto. Per l'estrazione del metabolita, dopo la coltura, raccogliere le cellule di lievito mediante centrifugazione e rimuovere rapidamente il surnatante.
Posizionare il tubo su ghiaccio secco e aggiungere due millilitri di meno 20 gradi Celsius cloroformio, un millilitro di meno 20 gradi Celsius metanolo, un millilitro di acqua nano pura ghiacciata e 200 microlitri di 425-600 micron di perle di vetro lavate con acido da 425 a 600 micron alle cellule. Quando le perle sono state aggiunte, posizionare il tubo coperto con un foglio di alluminio in un kit di supporto per tubi di schiuma con un fermo e vorticizzare il campione per 30 minuti a velocità media a quattro gradi Celsius per facilitare l'estrazione del metabolita. Quindi, incubare il tubo per 15 minuti su ghiaccio prima di centrifugare il campione per consentire la separazione della fase acquosa superiore dai detriti medi e dalle proteine e dalle fasi organiche inferiori.
Utilizzare una micropipetta per trasferire circa 400 microlitri della fase acquosa superiore in un tubo lavato ed etichettato da 1,5 millilitri contenente 800 microlitri di meno 20 gradi Celsius acetonitrile. Quindi centrifugare il campione e trasferire 800 microlitri della porzione superiore del surnatante in una fiala di spettrometria di massa etichettata per la conservazione a zero gradi fino all'analisi di spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida. Per separare i metaboliti estratti, ultrasonicare il flaconcino campione per 15 minuti, seguito da tre vortici di 10 secondi a temperatura ambiente.
Dopo aver vorticoso, posizionare la fiala nella piastra del pozzo del cromatografo liquido e impostare la colonna a 45 gradi Celsius con una portata di 0,25 millilitri al minuto e la piastra del pozzo a zero gradi Celsius. Quindi utilizzare la tabella per impostare i gradienti di cromatografia liquida per l'analisi. Dopo la separazione, utilizzare 10 volumi di campione di microlitro dell'iniezione in entrambe le modalità positiva e negativa della ionizzazione elettrospray in uno spettrometro di massa dotato di ionizzazione elettrospray riscaldata per identificare e quantificare i metaboliti solubili in acqua.
Alla fine dell'analisi, aprire i dati grezzi in un programma software di analisi dei composti appropriato e utilizzare la libreria di frammentazione spettrale di massa per abbinare gli spettri di massa per annotare i metaboliti identificati nell'analisi. Le masse esatte dei modelli MS1 e isotopici possono anche essere identificate per consentire l'annotazione dei metaboliti utilizzando database online. Quindi utilizzare la libreria di database e spettri per cercare gli spettri MS2 dei dati grezzi.
Il giorno dopo, dopo aver spento le cellule di lievito, lavare accuratamente le cellule con 15 millilitri di tampone ABC e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Rispeniare il pellet in un millilitro di tampone ABC fresco e aggiungere 500 microlitri della soluzione di ioduro di propidio alle cellule. Vortice del campione tre volte per 10 secondi per vortice e incubare le cellule per 10 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce.
Alla fine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e lavare le cellule tre volte con un millilitro di tampone ABC fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, risuscidere il pellet in 300 microlitri di tampone ABC fresco e aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare risultante a un vetrino per microscopio. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per acquisire immagini al contrasto di interferenza differenziale e microscopia a fluorescenza delle cellule con i filtri impostati su una lunghezza d'onda di eccitazione di 593 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 636 nanometri.
Quindi utilizzare un programma di analisi delle immagini appropriato per contare il numero totale di cellule nelle immagini del campo luminoso e della fluorescenza e per determinare l'intensità di fluorescenza della colorazione per le singole cellule. Il metodo di tempra cellulare modificato provoca danni significativamente inferiori alla membrana plasmatica e alla parete cellulare rispetto al metodo di tempra dell'80% non tamponato a meno 40 gradi Celsius. In effetti, quasi tutte le cellule sottoposte a tempra con il metodo modificato presentano un'emissione di fluorescenza rossa, che è caratteristica delle cellule di lievito in cui la membrana plasmatica e la parete cellulare non sono danneggiate.
Al contrario, quasi tutte le cellule sottoposte a tempra utilizzando il metodo non tamponato dell'80% di metanolo a 40 gradi Celsius hanno mostrato un'emissione di fluorescenza verde, che è caratteristica delle cellule di lievito in cui la membrana plasmatica e la parete cellulare sono significativamente danneggiate. Il metodo di tempra cellulare modificato causa anche perdite significativamente inferiori di metaboliti solubili in acqua dalle cellule di lievito rispetto al metodo di tempra dell'80% non tamponato a meno 40 gradi Celsius. I valori di spostamento del tempo di ritenzione degli standard dei metaboliti solubili in acqua sono significativamente più bassi e le forme del picco sono sostanzialmente più nitide per la colonna di fase zwitterionica rispetto alla colonna di fase inversa.
Un altro vantaggio del metodo di spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida è la capacità di utilizzare la colonna di fase zwitterionica per separare in modo efficiente diversi metaboliti solubili in acqua con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche. Assicurati di fare lo ioduro di propidio in piedi al buio e assicurati anche di raccogliere la fase superiore senza disturbare la fase centrale. Se un MSP non può essere annotato a causa della mancanza della libreria spettrale MS2, utilizzare una NMR per illustrare questa struttura.
