Reazioni di espressione libere da cellule di massa con piccole vescicole unilamellari (SUV) per applicazioni su cellule sintetiche

Per iniziare, soffiare un leggero getto di Argonne in una fiala di vetro contenente lipidi POPC mentre si ruota delicatamente la fiala. Quando i lipidi si sono asciugati sotto forma di pellicola sul fondo della fiala, tapparla senza stringere, quindi trasferirla in un desiccatore. Dopo un'ora aggiungere 0,5 millilitri di acqua deionizzata ultrapura per sciogliere il film lipidico.

Agitare la soluzione per due minuti. Quindi, immergere due supporti del filtro e l'acqua deionizzata. Posizionarli su ciascuno dei supporti interni della membrana.

Posizionare quindi un filtro in policarbonato a 100 nanometri tra i due supporti interni della membrana, tenuti insieme dall'involucro esterno dell'estrusore e dal dado di ritegno. Posizionare la configurazione nel supporto dell'estrusore per completare l'installazione dell'apparato di mini estrusione. Quindi, caricare la miscela di acqua lipidica in una siringa a tenuta stagna da un millilitro.

Utilizzare le clip del braccio oscillante per fissare la siringa a un'estremità del mini estrusore. Inserire la seconda siringa nell'altra estremità del mini estrusore, assicurandosi che sia completamente premuta. Ora passa la miscela di acqua lipidica dalla siringa originale a quella vuota attraverso l'apparato.

Dopo aver ripetuto l'estrusione 11 volte, trasferire i SUV in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per assemblare il protocollo di espressione cell-free, pipettare in una fiala le soluzioni da uno a 3 plasmidi di DNA codificanti per SFGFP solubile o varianti del recettore del glutammato SFGFP, RNAsi murino e soluzione SUV. Aggiungere acqua deionizzata ultrapura per portare il volume di reazione a 20 microlitri.

Trasferire la soluzione di espressione priva di cellule in una piastra inferiore a V conica a 96 pozzetti. Incubare la piastra in un lettore di piastre a 37 gradi Celsius per quattro o cinque ore. Configura il lettore di piastre con un guadagno di 100, un'eccitazione di 485 nanometri, un'emissione di 528 nanometri, un'autonomia di cinque ore e una misurazione a intervalli di una lettura ogni due minuti.

Misurare il segnale GFP ogni due minuti per monitorare la reazione senza cellule in tempo reale. La SFGFP solubile ha avuto la più alta espressione tra tutte e tre le proteine.