Per iniziare, preparare la soluzione tampone esterna GUV in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Miscelato insieme spermidina, ATP, GTP, CTP, UTP, creatina fosfato, acetato di magnesio, glutammato di potassio, HEPES, idrossido di potassio, acido folinico. glucosio e stock di aminoacidi.
Aggiungere acqua deionizzata ultra purificata per portare il volume finale della soluzione a un millilitro. Successivamente, in una cappa aspirante, aggiungere 17,3 microlitri di soluzione madre POPC a una fiala di vetro da 15 millilitri. A questo, pipettare 1,08 microlitri di copolimero PEO-b-PBD.
Soffiare con cautela un leggero flusso di gas argon nella fiala di vetro mentre si ruota la fiala per far evaporare il cloroformio. Quindi pipettare 1,2 millilitri di olio minerale leggero nella fiala di vetro. Agitare il lipide e l'olio alla massima velocità per 10-20 secondi.
Mettere la fiala di vetro in forno a circa 50 gradi Celsius per 20 minuti prima di agitare per altri 10-20 secondi alla massima velocità. Quindi, pipettare 270 microlitri della soluzione esterna GUV in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. A questo, pipettare 15 microlitri ciascuno di cloruro di sodio a cinque molari e cloruro di potassio a 4,5 molari.
Pipettare delicatamente 300 microlitri di miscela di lipidi e oli sopra la soluzione esterna di GUV. Dopo l'incubazione, assemblare una reazione CFE pipettando le soluzioni da 1 a 3, il plasmide di DNA codificante per sfGFP solubile o varianti del recettore del glutammato sfGFP, RNAsi murina e un molare di saccarosio in una fiala. Aggiungere acqua deionizzata ultrapura per portare il volume di reazione a 20 microlitri.
Aggiungere 600 microlitri della miscela di lipidi e oli alla provetta da microcentrifuga contenente la miscela di reazione da 20 microlitri. Pipettare energicamente su e giù per un minuto per emulsionare la reazione. Sovrapporre delicatamente l'emulsione interna sopra lo strato di olio nel tubo.
Centrifugare per 10 minuti a 2000 g a quattro gradi Celsius. Quindi, pipettare con cura l'olio in eccesso e la soluzione esterna dalla provetta della microcentrifuga. Mescolare delicatamente il pellet GUV nella soluzione rimanente per risospenderlo.
Trasferire la soluzione GUV in una piastra pulita a fondo piatto trasparente a 96 pozzetti per l'incubazione. Trasferire la piastra sigillata in un lettore di piastre per incubare a 37 gradi Celsius per cinque o sei ore. Dopo l'incubazione, posizionare la piastra su un microscopio confocale invertito.
Concentrati su una regione di interesse contenente i GUV, quindi cattura le immagini a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri. Salva le immagini in formato TIFF. Apri le immagini in un software di elaborazione delle immagini.
Fare clic sul pannello delle impostazioni Luminosità/Contrasto per aprirlo. Quindi regola la luminosità e il contrasto per rendere visibili le proteine fluorescenti. Le reazioni di espressione libera da cellule del recettore del glutammato wild-type incapsulate in GUV hanno dimostrato un'eccellente espressione e localizzazione di membrana.
Il recettore del glutammato PRSP era incline all'aggregazione e alla formazione di puntato. La sfGFP solubile è stata espressa in GUVS ed è rimasta nel lume di GUV.
