L'APL riconosce il sostegno della National Science Foundation (EF1935265), del National Institutes of Health (R01-EB030031 e R21-AR080363) e dell'Army Research Office (80523-BB)

I reagenti e le attrezzature utilizzate per questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.
1. Reazioni di massa di CFE in presenza di piccole vescicole unilamellari (SUV)
<ol><li>Preparazione SUV NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante seguendo le istruzioni di sicurezza per lavorare con il cloroformio.<ol><li>Preparare 5 mM di 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) SUV in un flaconcino di vetro trasferendo 76 μL di soluzione madre POPC 25 mg/mL disciolta in cloroformio.</li>
		<li>Ruotando delicatamente la fiala di vetro, soffiare un leggero flusso di argon nella fiala per formare una pellicola di lipidi secchi sul fondo. Quindi, trasferire la fiala di vetro in un essiccatore con il tappo avvitato in modo lasco per far evaporare il cloroformio in eccesso.</li>
		<li>Conservare il flaconcino di vetro nell'essiccatore per 1 ora. Quindi, aggiungere 0,5 ml di acqua deionizzata ultrapura per sciogliere il film lipidico e vorticare per circa 2 minuti.</li>
		<li>Installare un apparato di miniestrusione immergendo due supporti filtranti in acqua deionizzata e posizionandoli su ciascuno dei supporti interni della membrana. Quindi, immergere un filtro in policarbonato da 100 nm e posizionarlo tra i due supporti membrana interni tenuti insieme dall'involucro esterno dell'estrusore e dal dado di ritegno. Posiziona questa configurazione nel supporto dell'estrusore.</li>
		<li>Sciacquare due siringhe a tenuta di gas da 1 ml 3 volte con acqua deionizzata ultrapura.</li>
		<li>Caricare il campione di miscela lipidico-acqua in una delle siringhe a tenuta di gas da 1 ml e posizionarlo in un'estremità del mini estrusore utilizzando le clip a braccio oscillante per tenere la siringa in posizione. Inserisci la seconda siringa nell'altra estremità del mini-estrusore e assicurati che sia completamente premuta. NOTA: Quando si carica la siringa con la miscela di lipidi e acqua, assicurarsi che non ci sia aria nella siringa prima di farla passare attraverso il mini-estrusore.</li>
		<li>Passare delicatamente la miscela di acqua e lipidi dalla siringa originale alla siringa vuota attraverso l'apparato del mini-estrusore. Ripeti questo passaggio 11 volte per formare i SUV. Trasferire i SUV in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. NOTA: La soluzione SUV può essere conservata a 4 °C per un massimo di 2 settimane.</li>
	</ol></li>
	<li>Assemblaggio di reazione CFE<ol><li>Assemblare la reazione CFE seguendo il protocollo di espressione libera da cellule fornito dal produttore con lievi modifiche descritte di seguito.</li>
		<li>Miscelare 10 μl di soluzione 1 (contenente amminoacidi, NTP, tRNA e substrati per enzimi e tampone necessario), 1 μl di soluzione 2 (proteine in glicerolo al 20%), 2 μl di soluzione 3 (ribosoma (20 μM)), una quantità appropriata di DNA che codifica per sfGFP-sfCherry(1-10)27 solubile (di seguito denominato sfGFP solubile), WT-GluR0-sfGFP o PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 coppie di basi), 1 μL di inibitore dell'RNAsi murina e 4 μL di soluzione SUV da 5 mM per le proteine di membrana o 4 μL di acqua per le proteine solubili.</li>
		<li>Portare il volume finale della reazione a 20 μl aggiungendo acqua deionizzata ultrapura. NOTA: Durante il montaggio del sistema CFE, tutti i componenti devono essere tenuti in ghiaccio. Tutti i materiali sono sensibili alla temperatura e possono degradarsi se raggiungono la temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubazione e monitoraggio della reazione CFE<ol><li>Trasferire la soluzione CFE in una piastra conica a fondo V a 96 pozzetti. Per evitare l'evaporazione durante il corso della reazione, coprire la piastra con una pellicola sigillante.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 °C in un lettore di piastre per 4-5 ore mentre si monitora la reazione CFE misurando il segnale GFP con un guadagno di 100 a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 488 nm/528 nm ogni 2 minuti.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Reazioni CFE incapsulate in GUV
<ol><li>Preparazione della soluzione tampone esterna GUV<ol><li>In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, miscelare 1,5 μL di spermidina 1 M, 37,5 μL di ATP 100 mM, 25 μL di 100 mM GTP, 12,5 μL di 100 mM CTP, 12,5 μL di 100 mM UTP, 25 μL di 1 M di creatina fosfato, 18 μL di acetato di magnesio 1 M, 93,33 μL di glutammato di potassio 3 M, 50 μL di 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL di acido folinico 332 mM, 100 μL di glucosio 2 M e 50 μL dalla soluzione madre di una miscela di 6 mM di ciascuno dei 20 amminoacidi (preparata seguendo il protocollo descritto da Sun et al.28).</li>
		<li>Portare il volume finale della soluzione a 1 ml aggiungendo acqua deionizzata ultra-purificata. NOTA: Tutti i componenti devono essere tenuti in ghiaccio. Aggiungere la miscela di aminoacidi alla fine per evitare l'esaurimento degli aminoacidi28. La soluzione può essere aliquotata in aliquote da 330 μL e conservata a -20 °C fino al momento dell'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della miscela lipidica in olio NOTA: questo passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante seguendo le istruzioni di sicurezza per lavorare con il cloroformio.<ol><li>In una cappa aspirante, miscelare 17,3 μL di soluzione madre POPC da 25 mg/mL e 1,08 μL di copolimero poli(butadiene)-b-poli(ossido di etilene) (PEO-b-PBD) da 50 mg/mL in un flaconcino di vetro da 15 mL. NOTA: La soluzione finale di lipidi in olio contiene 0,5 mM di lipidi con il 95% e il 5% di POPC e PEO-b-PBD, rispettivamente. La PEO-b-PBD è stata utilizzata per migliorare la stabilità della membrana durante l'espressione proteica, ma è stata mantenuta a un basso rapporto molare per ridurre la tendenza del copolimero ad aggregarsi in micelle separate dalle molecole lipidiche29,30.</li>
		<li>Soffiare con cautela un leggero flusso di gas argon nella fiala di vetro mentre si ruota la fiala per far evaporare il cloroformio.</li>
		<li>Pipettare 1,2 mL di olio minerale leggero nella fiala di vetro da 15 mL contenente i lipidi essiccati.</li>
		<li>Mescolare i lipidi e l'olio agitando alla massima velocità per 10-20 s. La miscela lipidico-copolimero disciolta apparirà torbida.</li>
		<li>Per garantire che tutti i possibili aggregati lipidici nell'olio siano completamente disciolti e dispersi in tutto l'olio, porre la fiala di vetro in un forno a circa 50 °C per 20 minuti prima di agitare per altri 10-20 s alla massima velocità.</li>
	</ol></li>
	<li>Assemblaggio e incapsulamento della reazione CFE (la Figura 1 riassume i seguenti passaggi).<ol><li>Preparare 300 μl della soluzione esterna GUV in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL mescolando 270 μl di soluzione tampone esterna CFE preparata nella fase 2.1, 15 μl di NaCl 5 M e 15 μl di KCl 4,5 M. NOTA: A questo punto, aggiungere 0,45 μl di 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT) alla soluzione esterna GUV. Lo scopo dell'aggiunta di NaCl e KCl è quello di regolare l'osmolalità della soluzione esterna in modo che corrisponda alla soluzione interna di CFE. Il volume esatto di NaCl e KCl dipende dalla regolazione dell'osmolalità desiderata. Si può aggiungere NaCl o KCl o entrambi per regolare l'osmolalità.</li>
		<li>Pipettare delicatamente 300 μL di miscela di lipidi in olio sopra la soluzione esterna GUV. NOTA: Quando si aggiunge la miscela di olio lipidico, è importante che l'olio non si mescoli con la soluzione acquosa esterna. Dopo l'aggiunta, dovrebbe esserci un'interfaccia visibile tra la miscela di lipidi in olio e la soluzione esterna di GUV.</li>
		<li>Incubare l'interfaccia olio-acqua a temperatura ambiente per 2 ore per consentire al monostrato lipidico di formarsi e stabilizzarsi all'interfaccia.</li>
		<li>Nel frattempo, seguire la sezione 1.2.1 per assemblare una reazione CFE contenente il DNA plasmidico che codifica per le varianti proteiche di membrana o GFP solubile. Sostituire i 4 μl di soluzione SUV da 5 mM o l'acqua con 4 μl di saccarosio 1 M. Questa reazione sarà la soluzione interna del GUV. NOTA: Un osmometro è stato utilizzato per misurare l'osmolalità delle soluzioni interne ed esterne. L'osmolalità della soluzione esterna è stata quindi regolata di conseguenza mediante l'aggiunta di NaCl o acqua. L'osmolalità della reazione CFE è tipicamente di circa 1600 mOsm/Kg. L'aggiunta di saccarosio alla reazione aumenta la densità interna della soluzione, consentendo così alle vescicole di viaggiare attraverso l'interfaccia olio-acqua durante la fase di centrifugazione. Un'alternativa al saccarosio è la soluzione a gradiente di densità Opti-Prep.</li>
		<li>Aggiungere 600 μl di miscela di lipidi e oli alla provetta per microcentrifuga contenente la reazione CFE e pipettare su e giù energicamente per ~1 min per emulsionare la reazione in soluzione di lipidi in olio e formare il monostrato lipidico attorno alle cellule sintetiche. NOTA: La soluzione finale non deve avere bolle e deve apparire opaca.</li>
		<li>Pipettare delicatamente l'emulsione della soluzione interna sopra lo strato di olio nella provetta per microcentrifuga da 1,5 ml in cui è stata impostata l'interfaccia olio-acqua. NOTA: Fare attenzione a non disturbare o destabilizzare l'interfaccia.</li>
		<li>Centrifugare per 10 minuti a 2.000 x g a 4 °C. NOTA: La velocità di centrifugazione è stata ottimizzata per questo protocollo. Adir et al.31 hanno riportato una diversa velocità di centrifugazione.</li>
		<li>Una volta terminata la centrifugazione, rimuovere con cura l'olio in eccesso e la soluzione esterna dalla provetta della microcentrifuga utilizzando un pipettatore. Rimuovere la soluzione esterna fino a quando il volume rimanente è di circa 100 μL. NOTA: Un pellet di GUV è solitamente visibile sul fondo della provetta della microcentrifuga. Tuttavia, la mancanza di un pellet visibile non significa necessariamente che non ci sia resa in GUV. Invece di utilizzare un pipettatore, l'olio in eccesso sopra la soluzione esterna può essere rimosso mediante aspirazione. È fondamentale assicurarsi che la soluzione lipidica in olio sia completamente rimossa. La contaminazione da olio nella soluzione GUV può causare immagini di bassa qualità.</li>
		<li>Risospendere il pellet GUV nella soluzione rimanente da 100 μl pipettando delicatamente verso l'alto e verso il basso. Quindi, trasferire la soluzione GUV in una piastra a fondo piatto pulita e trasparente da 96 pozzetti per incubare.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Incubazione e imaging della reazione CFE incapsulata
<ol><li>Coprire la piastra con una pellicola sigillante per evitare l'evaporazione. Incubare la piastra a 37 °C per 5-6 ore. È possibile utilizzare un lettore di piastre e seguire il passaggio 1.3.2 per preparare il lettore di piastre per la fase di incubazione.</li>
	<li>Una volta terminata l'incubazione, posizionare la piastra a 96 pozzetti sul tavolino di imaging di un microscopio invertito dotato di una fotocamera EMCCD (o una fotocamera sCMOS), un laser controllato DAQ-MX (o un sistema di combinazione laser integrato) e un confocale a disco rotante CSU-X1 (o un confocale a scansione laser). Concentrati su qualsiasi ROI contenente GUV e acquisisci immagini a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm utilizzando un obiettivo Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA.</li>
	<li>Salva le immagini dei GUV in formato .tiff.</li>
	<li>Aprire le immagini in un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, ImageJ o Fiji). Aprire il pannello delle impostazioni Luminosità/Contrasto . Regola la luminosità e il contrasto su impostazioni appropriate che rendano visibili le proteine fluorescenti.</li>
	<li>Se l'obiettivo è confrontare l'intensità del segnale di diverse proteine espresse, per prima cosa impila singole immagini di GUV contenenti proteine diverse utilizzando il pannello Immagini da impilare situato nel sottomenu Immagine > Impila. Quindi, regolare la luminosità e il contrasto di tutte le immagini utilizzando il pannello Luminosità/Contrasto .</li>
</ol>

Espressione libera da cellule di proteine di membrana in vescicole unilamellari giganti

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Lin, A. J., Sihorwala, A. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+cell-free+biology.">The new age of cell-free biology.</a> Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-sized+mechanosensitive+and+biosensing+compartment+programmed+with+DNA.">Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA.</a> Chem. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762 (2013).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+conjugation+of+(tri-)+block+copolymers+to+liposomes+toward+the+construction+of+sterically+stabilized+vesicle+systems.">Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems.</a> Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).</li><li>Adir, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+protein+producing+synthetic+cells+using+cell+free+bacterial+extracts,+liposomes+and+emulsion+transfer.">Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer.</a> J Vis Exp. (158), e60829 (2020).</li><li>van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions.">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li><li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins.">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332 (2021).</li><li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation.">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse-phase+method+revisited:+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+(GUVs)+using+emulsification+followed+by+centrifugation.">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells:+A+membrane+perspective.">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Praticamente qualsiasi processo cellulare che dipende dal trasferimento di molecole o informazioni attraverso la membrana cellulare, come la segnalazione cellulare o l'eccitazione cellulare, richiede proteine di membrana. Pertanto, la ricostituzione delle proteine di membrana è diventata il principale collo di bottiglia nella realizzazione di vari progetti di cellule sintetiche per diverse applicazioni. La tradizionale ricostituzione mediata da detergenti delle proteine di membrana nelle membrane biologiche richiede met...

La biologia sintetica dal basso verso l'alto ha guadagnato un crescente interesse nell'ultimo decennio come campo emergente con numerose potenziali applicazioni nella bioingegneria, nella somministrazione di farmaci e nella medicina rigenerativa 1,2. Lo sviluppo di cellule sintetiche come pietra miliare della biologia sintetica bottom-up, in particolare, ha attratto un'ampia gamma di comunità scientifiche grazie alle promettenti applicazioni delle cellule sintetiche e alle loro proprietà fisiche e biochimiche simili a quelle cellulari che facilitano gli studi biofisici in vitro 3,4,5,6 . Le cellule sintetiche sono spesso ingegnerizzate in vescicole unilamellari giganti delle dimensioni di una cellula (GUV) in cui vengono ricreati diversi processi biologici. La ricostituzione del citoscheletro cellulare 7,8, la rigenerazione dell'energia dipendente dalla luce9, la comunicazione cellulare10,11 e il biosensing12 sono esempi di sforzi compiuti per ricostruire comportamenti simili a cellule nelle cellule sintetiche.
Mentre alcuni processi cellulari si basano su proteine solubili, molte caratteristiche delle cellule naturali, come il rilevamento e la comunicazione, spesso utilizzano proteine di membrana, inclusi canali ionici, recettori e trasportatori. Una delle principali sfide nello sviluppo delle cellule sintetiche è la ricostituzione delle proteine di membrana. Sebbene i metodi tradizionali di ricostituzione delle proteine di membrana nei doppi strati lipidici si basino sulla purificazione mediata da detergenti, tali metodi sono laboriosi, inefficaci per le proteine che sono tossiche per l'ospite di espressione, o spesso non sono adatti per la ricostituzione delle proteine di membrana nei GUVs13.
Un metodo alternativo per l'espressione proteica sono i sistemi di espressione libera da cellule (CFE). I sistemi CFE sono stati un potente strumento nella biologia sintetica che consente l'espressione in vitro di varie proteine utilizzando lisato cellulare o macchinari di trascrizione-traduzione purificati14. I sistemi CFE possono anche essere incapsulati in GUV, consentendo così reazioni di sintesi proteica compartimentate che possono essere programmate per varie applicazioni, come la creazione di cellule sintetiche che raccolgono la luce9 o biosensori meccanosensibili15,16. Analogamente ai metodi di espressione delle proteine ricombinanti, l'espressione delle proteine di membrana è impegnativa nei sistemi CFE17. L'aggregazione, il ripiegamento errato e la mancanza di modificazioni post-traduzionali nei sistemi CFE sono i principali colli di bottiglia che ostacolano il successo della sintesi proteica di membrana utilizzando i sistemi CFE. La difficoltà della ricostituzione delle proteine di membrana dal basso verso l'alto utilizzando sistemi CFE è dovuta in parte all'assenza di una complessa via di biogenesi delle proteine di membrana che si basa su peptidi segnale, particelle di riconoscimento del segnale, transloconi e molecole chaperoning. Tuttavia, recentemente, diversi studi hanno suggerito che la presenza di strutture membranose come microsomi o liposomi durante la traduzione promuove il successo dell'espressione delle proteine di membrana 18,19,20,21. Inoltre, Eaglesfield et al. e Steinküher et al. hanno scoperto che l'inclusione di specifici domini idrofobici noti come peptidi segnale nell'N-terminale della proteina di membrana può migliorare significativamente la sua espressione22,23. Nel complesso, questi studi suggeriscono che la sfida della ricostituzione delle proteine di membrana nelle cellule sintetiche può essere superata se la traduzione proteica avviene in presenza della membrana GUV e se viene utilizzato un peptide segnale N-terminale appropriato.
Qui viene presentato un protocollo per l'incapsulamento della sintesi proteica utilizzando reazioni CFE con elementi ricombinanti (PURE) per la ricostituzione delle proteine di membrana nei GUV. Il recettore batterico del glutammato24 (GluR0) è stato selezionato come proteina modello di membrana e ha studiato l'effetto del suo peptide segnale N-terminale sulla sua ricostituzione di membrana. L'effetto del peptide segnale della proteorodopsina, che ha dimostrato di migliorare l'efficienza della ricostituzione delle proteine di membrana da Eaglesfield et al.22, è studiato costruendo una variante mutata di GluR0 indicata come PRSP-GluR0 e la sua espressione e localizzazione di membrana con GluR0 wild-type (indicato come WT-GluR0 di seguito) che ospita il suo peptide segnale nativo. Questo protocollo si basa sul metodo dell'emulsione invertita25 con modifiche che lo rendono robusto per l'incapsulamento CFE. Nel metodo presentato, le reazioni CFE vengono prima emulsionate utilizzando una soluzione di lipidi in olio che genera goccioline di dimensioni micron che contengono il sistema CFE e sono stabilizzate dal monostrato lipidico. Le goccioline di emulsione vengono quindi stratificate sopra un'interfaccia olio-acqua che è satura di un altro monostrato lipidico. Le goccioline di emulsione sono quindi costrette a viaggiare attraverso l'interfaccia olio-acqua tramite la forza centrifuga. Attraverso questo processo, le goccioline ottengono un altro monostrato, generando così una vescicola lipidica a doppio strato. I GUV contenenti la reazione CFE vengono quindi incubati, durante i quali la proteina di membrana viene espressa e incorporata nella membrana GUV. Sebbene questo protocollo sia specificato per l'espressione libera da cellule di GluR0, può essere utilizzato per la sintesi libera da cellule di altre proteine di membrana o per diverse applicazioni cellulari sintetiche come la ricostituzione del citoscheletro o gli studi di fusione di membrana26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 nm polycarbonate filter</td>
			<td>STERLITECH</td>
			<td>1270193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>11-120-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10621714001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium (Optiprep)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optional to switch with sucrose in inner solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microtubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon X3 camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B933&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEO-b-PBD</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P41745-BdEO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC lipid in chloroform&#160;</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PUREfrex 2.0</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>GFK-PF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600</td>
			<td>ELITechGroup</td>
			<td>VAPRO 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of the bacterial glutamate receptor channel by encapsulation of a cell-free expression system

I sistemi di espressione libera cellulare (CFE) sono potenti strumenti nella biologia sintetica che consentono la biomimetica di funzioni cellulari come il biorilevamento e la rigenerazione di energia nelle cellule sintetiche. La ricostruzione di un'ampia gamma di processi cellulari, tuttavia, richiede la ricostituzione di successo delle proteine di membrana nella membrana delle cellule sintetiche. Mentre l'espressione di proteine solubili è solitamente efficace nei comuni sistemi CFE, la ricostituzione delle proteine di membrana nei doppi strati lipidici delle cellule sintetiche si è dimostrata impegnativa. Qui, viene dimostrato un metodo per la ricostituzione di una proteina modello di membrana, il recettore batterico del glutammato (GluR0), in vescicole unilamellari giganti (GUV) come cellule sintetiche modello basate sull'incapsulamento e l'incubazione della reazione CFE all'interno di cellule sintetiche. Utilizzando questa piattaforma, è stato dimostrato l'effetto della sostituzione del peptide segnale N-terminale di GluR0 con il peptide segnale della proteorhodopsina sulla traslocazione cotraduzionale di GluR0 nelle membrane di GUV ibridi. Questo metodo fornisce una procedura robusta che consentirà la ricostituzione senza cellule di varie proteine di membrana in cellule sintetiche.

Bottom-up synthetic biology has gained increasing interest over the past decade as an emerging field with numerous potential applications in bioengineering, drug delivery, and regenerative medicine1,2. The development of synthetic cells as a cornerstone of bottom-up synthetic biology, in particular, has attracted a wide range of scientific communities due to the promising applications of synthetic cells as well as their cell-like physical and biochemical properties that facilitate in vitro biophysical studies3,4,5,6. Synthetic cells are often engineered in cell-sized giant unilamellar vesicles (GUVs) in which different biological processes are recreated. Reconstitution of cell cytoskeleton7,8, light-dependent energy regeneration9, cellular communication10,11, and biosensing12 are examples of efforts made to reconstruct cell-like behaviors in synthetic cells.
While some cellular processes rely on soluble proteins, many characteristics of natural cells, such as sensing and communication, often utilize membrane proteins, including ion channels, receptors, and transporters. A major challenge in synthetic cell development is the reconstitution of membrane proteins. Although traditional methods of membrane protein reconstitution in lipid bilayers rely on detergent-mediated purification, such methods are laborious, ineffective for proteins that are toxic to the expression host, or are often not suited for membrane protein reconstitution in GUVs13.
An alternative method for protein expression is cell-free expression (CFE) systems. CFE systems have been a powerful tool in synthetic biology that allows in vitro expression of various proteins using either cell lysate or purified transcription-translation machinery14. CFE systems can also be encapsulated in GUVs, thus allowing compartmentalized protein synthesis reactions that can be programmed for various applications, such as the creation of light-harvesting synthetic cells9 or mechanosensitive biosensors15,16. Analogous to recombinant protein expression methods, membrane protein expression is challenging in CFE systems17. Aggregation, misfolding, and lack of post-translational modification in CFE systems are major bottlenecks that hinder successful membrane protein synthesis using CFE systems. The difficulty of bottom-up membrane protein reconstitution using CFE systems is due in part to the absence of a complex membrane protein biogenesis pathway that relies on signal peptides, signal recognition particles, translocons, and chaperoning molecules. However, recently, multiple studies have suggested that the presence of membranous structures such as microsomes or liposomes during translation promotes successful membrane protein expression18,19,20,21. Additionally, Eaglesfield et al. and Steink&#252;her et al. have found that the inclusion of specific hydrophobic domains known as signal peptides in the N-terminus of the membrane protein can significantly improve its expression22,23. Altogether, these studies suggest that the challenge of membrane protein reconstitution in synthetic cells can be overcome if the protein translation occurs in the presence of the GUV membrane and if proper N-terminal signal peptide is utilized.
Here, a protocol for encapsulation of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) CFE reactions for membrane protein reconstitution in GUVs is presented. Bacterial glutamate receptor24 (GluR0) is selected as the model membrane protein, and the effect of its N-terminal signal peptide on its membrane reconstitution is studied. The effect of proteorhodopsin signal peptide, which was shown to improve membrane protein reconstitution efficiency by Eaglesfield et al.22, is investigated by constructing a mutated variant of GluR0 denoted as PRSP-GluR0 and its expression and membrane localization with wild-type GluR0 (referred to as WT-GluR0 hereafter) that harbors its native signal peptide is compared. This protocol is based on the inverted emulsion method25 with modifications that make it robust for CFE encapsulation. In the presented method, the CFE reactions are first emulsified using a lipid-in-oil solution that generates micron-sized droplets that contain the CFE system and are stabilized by the lipid monolayer. The emulsion droplets are then layered on top of an oil-water interface that is saturated with another lipid monolayer. The emulsion droplets are then forced to travel across the oil-water interface via centrifugal force. Through this process, the droplets obtain another monolayer, thus generating a bilayer lipid vesicle. The GUVs containing the CFE reaction are then incubated, during which the membrane protein is expressed and incorporated into the GUV membrane. Although this protocol is specified for cell-free expression of GluR0, it can be used for cell-free synthesis of other membrane proteins or different synthetic cell applications such as cytoskeleton reconstitution or membrane fusion studies26.

Autore in primo piano: Ricostituzione delle proteine di membrana nelle cellule sintetiche

Ricostituzione del canale del recettore del glutammato batterico mediante incapsulamento di un sistema di espressione libero da cellule

Our protocol addresses the reconstitution of a membrane protein within the lipid bilayer of a synthetic cell made using the inverted droplet emulsion method. The advantage of using the inverted droplet emulsion method is its ability to generate synthetic cells that provide a stable environment for the cell-free expression of membrane proteins. Our protocol offers a robust method for researchers in the field to synthesize membrane proteins inside synthetic cells using cell-free expression system.My lab is working on reconstituting various ion channels in synthetic cells through the reconstitution of the action potential by a well-defined set of ion channels.

Prima dell'incapsulamento delle reazioni CFE, due varianti di GluR0-sfGFP che ospitano peptidi segnale nativi e proteorhodopsina (le sequenze di peptidi segnale sono presentate nella Tabella supplementare 1) e la sfGFP solubile sono state espresse individualmente in reazioni di massa e la loro espressione è stata monitorata rilevando il segnale sfGFP utilizzando un lettore di piastre (Figura 2A). Le proteine di membrana sono state espresse in assenza o pres...

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Protein Reconstitution in Synthetic Cells at JoVE.com

Questo protocollo descrive il metodo dell'emulsione invertita utilizzato per incapsulare un sistema di espressione libera da cellule (CFE) all'interno di una vescicola unilamellare gigante (GUV) per lo studio della sintesi e dell'incorporazione di una proteina modello di membrana nel doppio strato lipidico.

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

Il nostro protocollo riguarda la ricostituzione di una proteina di membrana all'interno del doppio strato lipidico di una cellula sintetica realizzata con il metodo dell'emulsione di goccioline invertite. Il vantaggio dell'utilizzo del metodo dell'emulsione di goccioline invertite è la sua capacità di generare cellule sintetiche che forniscono un ambiente stabile per l'espressione libera da cellule delle proteine di membrana. Il nostro protocollo offre un metodo robusto per i ricercatori del settore per sintetizzare proteine di membrana all'interno di cellule sintetiche utilizzando un sistema di espressione cell-free.Il mio laboratorio sta lavorando alla ricostituzione di vari canali ionici in cellule sintetiche attraverso la ricostituzione del potenziale d'azione da parte di un insieme ben definito di canali ionici.

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

787 Views.  University of Michigan, Ann Arbor. Il nostro protocollo riguarda la ricostituzione di una proteina di membrana all'interno del doppio strato lipidico di una cellula sintetica realizzata con il metodo dell'emulsione di goccioline invertite. Il vantaggio dell'utilizzo del metodo dell'emulsione di goccioline invertite è la sua capacità di generare cellule sintetiche che forniscono un ambiente stabile per l'espressione libera da cellule delle proteine di membrana. Il nostro protocollo offre un metodo robusto per i ricercatori de...

Video: Autore in primo piano: Ricostituzione delle proteine di membrana nelle cellule sintetiche

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy regeneration in synthetic cells. Reconstruction of a wide range of cellular processes, however, requires successful reconstitution of membrane proteins into the membrane of synthetic cells. While the expression of soluble proteins is usually successful in common CFE systems, the reconstitution of membrane proteins in lipid bilayers of synthetic cells has proven to be challenging. Here, a method for reconstitution of a model membrane protein, bacterial glutamate receptor (GluR0), in giant unilamellar vesicles (GUVs) as model synthetic cells based on encapsulation and incubation of the CFE reaction inside synthetic cells is demonstrated. Utilizing this platform, the effect of substituting the N-terminal signal peptide of GluR0 with proteorhodopsin signal peptide on successful cotranslational translocation of GluR0 into membranes of hybrid GUVs is demonstrated. This method provides a robust procedure that will allow cell-free reconstitution of various membrane proteins in synthetic cells.

This protocol describes the inverted emulsion method used to encapsulate a cell-free expression (CFE) system within a giant unilamellar vesicle (GUV) for the investigation of the synthesis and incorporation of a model membrane protein into the lipid bilayer.

Ricerca

Bioingegneria

Bulk Cell-Free Expression Reactions with Small Unilamellar Vesicles (SUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, blow a gentle stream of Argonne into a glass vial containing POPC lipids while gently rotating the vial. When the lipids have dried as a film at the bottom of the vial, loosely cap it, then transfer it to a desiccater. After one hour add 0.5 milliliters of ultrapure deionized water to dissolve the lipid film.Vortex the solution for two minutes. Next, soak two filter supports and deionized water. Place them on each of the internal membrane supports.Then place a 100 nanometer polycarbonate filter between the two internal membrane supports, held together by the extruder outer casing and retainer nut. Place the setup in the extruder stand to finish setting up the mini extrusion apparatus. Next, load the lipid water mix into a one milliliter gast tight syringe.Use swing arm clips to secure the syringe into one end of the mini extruder. Insert the second syringe into the other end of the mini extruder, making sure that it is fully depressed. Now pass the lipid water mix from the original syringe into the empty one through the apparatus.After repeating the extrusion 11 times, transfer the SUVs to a 1.5 milliliter micro centrifuge tube. To assemble the cell-free expression protocol, pipette solutions one to 3 DNA plasmid encoding for soluble SFGFP or variants of glutamate receptor SFGFP, murine RNAse, and SUV solution into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Transfer the cell-free expression solution to a 96 well conical V bottom plate. Incubate the plate in a plate reader at 37 degrees Celsius for four to five hours. Set up the plate reader with a gain of 100, excitation of 485 nanometers, emission of 528 nanometers, a runtime of five hours, and an interval measurement of one read for every two minutes.Measure the GFP signal every two minutes to monitor the cell-free reaction in real time. Soluble SFGFP had the highest expression among all three proteins.

Reazioni di espressione libere da cellule di massa con piccole vescicole unilamellari (SUV) per applicazioni su cellule sintetiche

Cell-Free Reactions in Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, prepare the GUV outer buffer solution in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Mixed together spermidine, ATP, GTP, CTP, UTP, creatine phosphate, magnesium acetate, potassium glutamate, HEPES, potassium hydroxide, folinic acid. glucose, and amino acid stock.Add ultra purified deionized water to bring the final volume of the solution to one milliliter. Next, in a fume hood, add 17.3 microliters of POPC stock solution to a 15-milliliter glass vial. To this, pipette 1.08 microliters of PEO-b-PBD copolymer.Carefully blow a gentle stream of argon gas into the glass vial while rotating the vial to evaporate the chloroform. Then pipette 1.2 milliliters of light mineral oil into the glass vial. Vortex the lipid and oil at maximum speed for 10 to 20 seconds.Place the glass vial in an oven at around 50 degrees Celsius for 20 minutes before vortexing for an additional 10 to 20 seconds at maximum speed. Next, pipette 270 microliters of the GUV outer solution into a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. To this, pipette 15 microliters each of five molar sodium chloride and 4.5 molar potassium chloride.Gently pipette 300 microliters of lipid and oil mixture on top of the GUV outer solution. After incubation, assemble a CFE reaction by pipetting Solutions 1 to 3, DNA plasmid encoding for soluble sfGFP or variants of glutamate receptor sfGFP, murine RNAse, and one molar sucrose into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Add 600 microliters of the lipid-oil mixture to the microcentrifuge tube containing the 20-microliter reaction mixture. Pipette up and down vigorously for one minute to emulsify the reaction. Gently layer the inner emulsion on top of the oil layer in the tube.Centrifuge for 10 minutes at 2000 g at four degrees Celsius. Next, carefully pipette out the excess oil and outer solution from the microcentrifuge tube. Gently mix the GUV pellet in the remaining solution to resuspend it.Transfer the GUV solution to a clean 96-well clear flat bottom plate for incubation. Transfer the sealed plate into a plate reader to incubate at 37 degrees Celsius for five to six hours. After incubation, place the plate on an inverted confocal microscope.Focus on a region of interest containing the GUVs, then capture the images at an excitation wavelength of 488 nanometers. Save the images in the TIFF format. Open the images in an image processing software.Click on the Brightness/Contrast setting panel to open it. Then adjust the brightness and contrast to make the fluorescent proteins visible. The wild-type glutamate receptor cell-free expression reactions encapsulated in GUV demonstrated excellent expression and membrane localization.PRSP-glutamate receptor was prone to aggregation and punctate formation. The soluble sfGFP was expressed in GUVS and stayed in the GUV lumen.