Per iniziare, prendi una coltura confluente dal 70 al 90% di fibroblasti uterini umani. Aspirare il terreno dai palloni Lavare le cellule con cinque millilitri di DPBS caldo privo di calcio e magnesio.
Dopo aver aspirato il DPBS, pipettare quattro millilitri di tripsina EDTA calda in ciascun pallone. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti fino a quando le cellule non si staccano. Quindi, aggiungi sei millilitri di gocce e soluzione neutralizzante in ogni pallone.
Quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri. Utilizzare una pipetta per miscelare bene la sospensione e prelevare un'aliquota da 10 microlitri per la conta cellulare. Mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 microlitri di Trypan Blue.
Trasferire la sospensione cellulare colorata in un emocitometro per il conteggio delle cellule. Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet in un mezzo caldo di fibroblasti.
Ora lava il canale basale di un chip di organo microfluidico con 200 microlitri di terreno fibroblastico. Quindi lavare il canale apicale con 200 microlitri di terreno epiteliale vaginale riscaldato. Aggiungere 200 microlitri di terreno epiteliale vaginale completo all'ingresso del canale apicale, tappando l'uscita con un puntale per pipetta.
Erogare il fluido fino a quando i volumi dei puntali di ingresso e uscita non sono uguali. Quindi rilasciare il puntale della pipetta dalla pipetta, lasciando il puntale nell'ingresso. Pipettare lentamente 50 microlitri della sospensione di cellule di fibroblasti uterini umani nell'ingresso del canale basale, aspirando contemporaneamente dall'uscita.
Rimuovere il puntale della pipetta dall'ingresso quando rimangono circa due microlitri della sospensione cellulare nel puntale della pipetta. Capovolgere i chip della spina su una griglia per provette da 15 millilitri. Controllare i chip dopo l'incubazione per l'attacco delle cellule.
Quindi, tappare l'uscita del canale basale con un puntale per pipetta. Quindi aggiungere 200 microlitri di terreno fibroblastico all'ingresso del canale basale senza spingere verso il basso lo stantuffo della pipetta. Rilasciare il puntale dalla pipetta per consentire al fluido di fluire liberamente attraverso il canale fino al puntale della pipetta di uscita mediante flusso gravitazionale.
Incubare le patatine con semi di fibroblasti per una notte a 37 gradi Celsius con un'integrazione di anidride carbonica al 5%.
