Prima di collegare il tubo sterilizzato al biochip, lavare il tubo con 200 microlitri di PBS e 200 microlitri di terreno EC. Dopo aver lavato la camera superiore e inferiore con il terreno di coltura cellulare appena preparato, inserire il serbatoio sul lato di uscita del biochip e collegare il serbatoio con il tubo all'ingresso del biochip. Per il mezzo di profusione circolare, collegare il tubo al serbatoio e al biochip.
Ora riempi il serbatoio con 500 microlitri di terreno EC. Collegare il biochip con il tubo per avviare la profusione a una portata di 21 microlitri al minuto. Il giorno successivo, ferma la profusione e svuota i serbatoi.
Sotto un armadietto di sicurezza sterile, pipettare 500 microlitri di terreno EC nei serbatoi e lavare delicatamente la camera inferiore con 200 microlitri di terreno RPMI plus. Quindi riavviare la perfusione a una velocità di flusso di 21 microlitri al minuto. Per stabilire un'interfaccia aria-liquido dal giorno 12 al giorno 14, aprire i tappi nella camera inferiore e assorbire accuratamente il fluido fino a quando non è visibile una bolla d'aria.
Dopo essersi assicurati che tutto il liquido dal canale e dalla camera sia stato rimosso, chiudere accuratamente le porte, riempire il serbatoio con terreno EC vascolare appena preparato e continuare la coltura a profusione solo nella camera superiore fino al giorno 14. Scollegare i biochip dal sistema di flusso. Dopo aver rimosso il tubo, esaminare gli strati cellulari dal biochip al microscopio per verificare la presenza di confluenze cellulari.
Lavare le cavità dei biochip con PBS per rimuovere il terreno di coltura cellulare. Aggiungere 300 microlitri di soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS nella camera superiore e 200 microlitri nella camera inferiore. Dopo 10 minuti di incubazione, lavare la camera tre volte con PBS.
Per la permeabilizzazione, aggiungere 300 microlitri di Triton X 100 allo 0,25% in PBS e incubare per 30 minuti, dopo il lavaggio con PBS, pipettare 300 microlitri di albumina sierica bovina al 3% in PBS in entrambe le camere e incubare per un'ora. Per la colorazione immunofluorescente, preparare 50 microlitri di soluzioni anticorpali utilizzando il 3% di BSA per ciascuna membrana utilizzando rapporti di diluizione appropriati. Per accedere alle cellule all'interno del biochip, eseguire un taglio preciso all'esterno della cavità e rimuovere la lamina di legame.
Usando un bisturi, tagliare la membrana rimuovendo i bordi sigillati al biochip. Dopo aver diviso la membrana in due pezzi, raccogliere i pezzi di membrana con una pinzetta e posizionarli su un vetrino microscopico per la colorazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione anticorpale a ciascun pezzo di membrana e incubare per una notte a quattro gradi Celsius, proteggendoli dalla luce. Dopo aver lavato la membrana tre volte con PBS, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino etichettato e posizionare la membrana corrispondente.
Aggiungere una goccia del mezzo di montaggio sulla parte superiore della membrana e posizionare un vetro di copertura. La colorazione in immunofluorescenza delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana ha rivelato alterazioni morfologiche e l'espressione della marcoproteina dopo 14 giorni di co-coltura. Sul lato vascolare, l'espressione coerente di V ai bordi delle cellule endoteliali suggeriva la confluenza e la formazione di barriere endoteliali.
Il lato epiteliale è stato valutato per l'espressione dell'ecaherrina e della proteina A del tensioattivo, indicando l'integrità e la funzione dell'epitelio alveolare.
