Il nostro protocollo espande l'utilizzo di G.mellonella da modello di infezione sistemica a modello che consente la somministrazione batterica attraverso la via orale naturale. G.mellonella è un modello sostitutivo adatto per i roditori nell'analisi di diversi segni distintivi delle interazioni micro-post innate in quanto le larve possono essere utilizzate per batteri patogeni umani. Inizia trasferendo le uova deposte dalle tarme adulte in scatole da due litri contenenti substrato di falena di cera, a 30 gradi Celsius, al buio.
Dopo una o due settimane, trasferire 25 grammi di larva contenente substrato in substrato fresco, quando la larva piccola e piccola diventa visibile. Sincronizza le larve dopo due settimane in base alle loro dimensioni, in gruppi da 30 a 40 larve in nuovi contenitori da due litri su substrato di falena di cera. Dopo due settimane, seleziona le larve per l'esperimento in base al peso.
Usando solo larve pallide e in rapido movimento con una massa da 180 a 200 milligrammi. Per forzare l'alimentazione delle larve, caricare una siringa per insulina con un ago smussato per l'applicazione orale, con uno per 10 al settimo batterio per 10 microlitri di DPBS per larva. Caricare la siringa in una pompa a microsiringa.
Attendere che una larva apra le parti della bocca prima di inserire attentamente la siringa tra le mattidi e fornire i batteri. Quando tutta la larva è stata nutrita, incubare gli animali al buio a 37 gradi Celsius, da una a 24 ore. Per la lavorazione delle larve, pulire una cappa di sicurezza con etanolo e reagente spray per prevenire la contaminazione da RNasi.
Snap congela la larva vivente in azoto liquido. Omogeneizzare ogni singola larva congelata usando un mortaio e un pestello e un piccolo volume di azoto liquido. Quando è stato prodotto un omogeneato in polvere, trasferire l'omogeneato su una barca di attesa usa e getta e attendere che l'azoto liquido evapori.
Quando tutta la larva è stata omogeneizzata, mescolare gli omogeneati in polvere con un millilitro di TRIzol in un tubo a due millilitri. Incubare la miscela a temperatura ambiente per un'ora. Alla fine dell'incubazione, pellettizzare l'omogeneato per centrifugazione.
Trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Mescolare il supernatante con 200 microlitri di 1-Bromo-3-cloropropano, o BCP. Vortice e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, seguito da un'incubazione di 10 minuti sul ghiaccio.
Alla fine della seconda incubazione, centrifugare la reazione aggiunta dal BCP e trasferire lo strato trasparente superiore in un nuovo tubo da due millilitri. Precipitare l'RNA dello strato superiore trasferito con 500 microlitri di isopropanolo mescolando e invertendo il tubo per cinque minuti. Quindi raccogliere l'RNA precipitato per centrifugazione.
Lavare il pellet di RNA precipitato con 500 microlitri di etanolo al 75% e asciugare l'RNA per cinque-10 minuti a temperatura ambiente. Quando l'etanolo è evaporato, aggiungere 100 microlitri di inibitore della ribonucleasi in acqua priva di nucleasi al pellet di RNA essiccato e vortice con cura il tubo fino a quando il pellet non è completamente sciolto. Misurare la qualità e la quantità dell'RNA in base ai protocolli standard, assicurando che il rapporto tra 260 e 280 sia di circa due, e il rapporto da 260 a 230 sia nell'intervallo da due a 2,2.
Quindi utilizzare cinque microgrammi dell'RNA isolato per la digestione della DNasi e l'analisi dell'espressione genica, secondo protocolli standard. G.mellonella è in grado di cancellare la forza iniziale alimentata carica batterica fino a quando nessun batterio non è rilevabile. Con i numeri di copia genica 16s sia di B.vulgatus che di E.coli diminuirono sostanzialmente entro 24 ore.
Commensal somministrava una larva di G.mellonella inducendo l'espressione genica dell'RNA di vari geni marcatori immunitari innati. Ad esempio, le molecole di riconoscimento LPS, l'apolipophorina e l'emolina sono generalmente espresse più altamente nelle larve somministrate dall'E.coli rispetto alle larve somministrate da B.vulgatus. Inoltre, la produzione di specie reattive di ossigeno e azoto è fortemente elevata rispetto all'alimentazione della forza E.coli rispetto al B.vulgatus, così come all'espressione genica GST antiossidante.
Inoltre, l'espressione differenziale del peptide microbico è indotta più fortemente dopo la somministrazione di E.coli che in risposta all'alimentazione forzata di B.vulgatus. Ricorda di usare solo larve sane, bianche e in rapido movimento, per usare la pazienza durante l'alimentazione forzata per evitare di stressare le larve e includere tutti i controlli necessari. L'attivazione dei marcatori immunitari G.mellonella può essere determinata direttamente dai test di attività RUS o GST e l'abbondanza di ANP può essere determinata da test di inibizione della crescita batterica.
Questa tecnica può essere utilizzata come strumento di screening per batteri commensali e patogeni e per esplorare simbiomi intestinali e pathobiomi senza sacrificare molti vertebrati. Utilizzare sempre i dispositivi di protezione individuale appropriati quando si lavora con azoto liquido, BCP o sostanze TRIzol.
