Per iniziare, pipettare 10 microlitri di soluzione peptidica 2X al centro dei pozzetti in una piastra da 24 pozzetti. Dopo l'incubazione, pipettare 10 microlitri di PBS 2X in ciascun pozzetto. Utilizzare la punta della pipetta per mescolare delicatamente la soluzione, lasciare stabilizzare le goccioline di gel per almeno 20 minuti, assicurandosi che le goccioline siano intatte.
Successivamente, pipettare 2,5 millilitri di tripsina EDTA allo 0,0125% in un pallone contenente 2 milioni di cellule di adenocarcinoma colorettale umano SW1222. Incubare le cellule con tripsina a 37 gradi Celsius per 5-10 minuti fino a quando non si staccano dal pallone. Aggiungere cinque millilitri di terreno completo per inattivare la tripsina.
Quindi filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 30 micrometri. Con una micropipetta da 10 microlitri, iniettare due microlitri della sospensione cellulare in ciascuna gocciolina di peptide. Seminare 800 cellule della linea cellulare SW1222 in ciascun pozzetto per quattro giorni.
Incubare le goccioline per 30 minuti a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di terreno integrato a ciascun pozzetto. Per preparare il controllo, diluire lo stock del controllo della matrice a membrana basale con un mezzo integrato.
Caricare la sospensione cellulare nella soluzione basamentale a membrana diluita. Pipettare 20 microlitri di matrice di membrana basale diluita in ciascun pozzetto con le cellule. Incubare le cellule per 20 minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo che le goccioline si sono solidificate, aggiungere 0,5 millilitri di terreno completo. Visualizzare le cellule utilizzando un microscopio a campo chiaro nei giorni uno, quattro e sette per valutare la crescita degli organoidi. Una settimana di imaging in campo chiaro delle cellule ha mostrato che i piccoli gruppi di cellule si stavano assemblando in organoidi.
Gli organoidi derivati da SW1222 coltivati in idrogel peptidici avevano una morfologia rotonda con un aspetto leggero. Un aspetto più scuro indicava una densità indesiderabile più elevata, come si vede nelle colonie nel peptide P il settimo giorno.
