Immunocolorazione di organoidi derivati dal cancro del colon-retto in idrogel peptidico

Per iniziare, pipettare 20 microlitri di idrogel peptidico in una piastra a 24 pozzetti. Seminare 800 cellule della linea cellulare SW1222 in ciascun pozzetto per quattro giorni. Il quarto giorno, pipettare il terreno.

Lavare ogni pozzetto due volte con PBS. Quindi, aggiungere 400 microlitri di soluzione di formaldeide al 4% nei pozzetti. Una volta completata l'incubazione, utilizzare un puntale per pipetta P1000 per aspirare la soluzione di formaldeide.

Quindi, lavare nuovamente i pozzetti con PBS. Incubare le cellule in un millilitro di tampone di permeabilizzazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver pipettato il tampone e lavato i pozzetti con PBS, aggiungere 0,5 millilitri di tampone bloccante.

Ora, lava i pozzetti con PBS dopo aver rimosso il tampone di blocco. Quindi, pipettare 200 microlitri di anticorpo primario diluito nei pozzetti. Incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius.

Con un puntale per pipetta P200, rimuovere la soluzione. Quindi, lavare i pozzetti con una soluzione di PBS. Quindi, aggiungere la falloidina coniugata a una fiala di anticorpo secondario diluito nel rapporto di uno a 40.

Pipettare questa miscela nei pozzetti della piastra. Quindi, incubare la piastra a temperatura ambiente per tre ore al buio. Dopo aver aspirato la soluzione e lavato i pozzetti con PBS, pipettare 300 microlitri di soluzione DAPI in ogni pozzetto.

Dopo l'incubazione, lavare nuovamente i pozzetti con PBS dopo aver pipettato la soluzione. Conservare la piastra a quattro gradi Celsius per un massimo di sette giorni. L'immunocolorazione ha dimostrato che gli organoidi presenti nel peptide P, nel peptide P1 biofunzionalizzato e nel Matrigel sono stati localizzati nelle membrane apicali e basolaterali.

Il peptide P non biofunzionale induce l'espressione della giunzione cellula-cellula nella membrana basolaterale.