Per iniziare, taglia le reti metalliche in strisce di 25 per 8 millimetri. Posizionare le reti personalizzate in un contenitore di sterilizzazione e in autoclave per due ore. Dopo la sterilizzazione in autoclave, posizionare il contenitore di sterilizzazione e le fiale da 1,8 millilitri sotto il banco a flusso laminare.
Aprire il contenitore di sterilizzazione e rimuovere la griglia metallica. Inserire la griglia nel tappo del flaconcino da 1,8 millilitri e chiudere il flaconcino. Dopo aver raccolto il tessuto della corteccia ovarica umana, rimuovere il midollo e tagliare il tessuto nelle forme desiderate.
Aggiungere cinque millilitri di soluzione di vitrificazione 1 nel primo pozzetto della piastra a sei pozzetti. Utilizzando il colino cellulare, equilibrare il tessuto della corteccia ovarica per cinque minuti nel pozzetto 1 della piastra. Spostare il colino cellulare con il tessuto della corteccia sul pozzetto 2 contenente cinque millilitri di soluzione di vitrificazione 2 ed equilibrare per cinque minuti.
Quindi, posizionare il colino contenente tessuto cortex nel pozzetto 3 di una piastra a sei pozzetti, contenente cinque millilitri di soluzione di vitrificazione 3 per sei minuti. Riempire la fiala criogenica preparata con azoto liquido sterilizzato e posizionarla nel recipiente criogenico riempito con azoto liquido. Caricare i campioni di tessuto sulla griglia metallica del dispositivo di vetrificazione entro un minuto.
Quindi inserire la griglia metallica nell'azoto liquido nella fiala criogenica a griglia. Aggiungere sei millilitri di soluzione di equilibrazione al pozzetto 1 di una piastra sterile a sei pozzetti, quindi trasferire sei millilitri di RS, ciascuno ai pozzetti 2 e 3. Incubare per un'ora a temperatura ambiente.
Riscaldare la soluzione a riscaldamento rapido in un becher sterile per campioni per un'ora su una piastra riscaldante impostata a 37 gradi Celsius. Sotto il banco a flusso laminare, aprire le fiale crioconservate contenenti tessuto corticale ovarico vetrificato. Trasferire rapidamente la rete nella soluzione di riscaldamento rapido.
Utilizzando una pinza sterile, trasferire il tessuto nella soluzione di equilibrio e incubare per tre minuti su un agitatore a dondolo. Quindi, sciacquare il fazzoletto a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno con RS1 e RS2 su uno shaker a dondolo. Sciogliere la calceina in 100 microlitri di DMSO.
Trasferire tre microlitri di calceina sul fondo di una provetta da 1,5 millilitri e conservare a meno 20 gradi Celsius. Aggiungere 0,007 grammi di collagenasi in un tubo da 1,5 millilitri e conservare il tubo a meno 20 gradi Celsius. Aggiungere 997 microlitri di DPBS ai tre microlitri congelati di calceina e risospendere per sciogliere la calceina.
Quindi aggiungere la polvere di collagenasi fredda per ottenere 1000 microlitri di soluzione di lavoro. Quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di calceina di lavoro e trasferire due pezzi di due millimetri di frammenti di corteccia ovarica nei pozzetti di un piatto a quattro pozzetti. Quindi incubare per 90 minuti a 37 gradi Celsius, proteggendo dalla luce.
Infine, al microscopio a fluorescenza, determinare la vitalità follicolare.
