Name: quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis
Uploaded: 2016-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
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This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).

Tutti gli studi in vivo sono stati approvati dalla University of Notre Dame cura degli animali e del Comitato uso e utilizzati femminili topi C57 / BL6J. 1. murino Ovarian Cancer Cell Culture <ol><li> Rendere il murino terreno di coltura delle cellule del cancro ovarico ID8 come segue: 1 L di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con 4% siero fetale bovino (FBS), 1% penicillina / streptomicina, 5 mg / Insulina ml, 5 mg / ml transferrina e 5 ng / ml di sodio selenite. </li><li> Trasdurre ID8 murine cellule di cancro ovarico 13 per esprimere proteine ​​rosso fluorescente (RFP) utilizzando particelle lentivirali commercialmente acquistati che esprimono RFP e un marcatore di selezione (blasticidin gene). Si noti che la proteina fluorescente verde può essere utilizzato, ma fornisce un segnale di fluorescenza debole. <ol><li> Immediatamente prima di trasduzione, le cellule di coltura per 50 - 70% di confluenza e aggiungere mezzo fresco (senza penicillina / streptomicina), che include 1 ml polibrene (5 mg / ml finaleconcentrazione). </li><li> Delicatamente pipetta RFP-lentivirus (20 ml) goccia a goccia nel piatto e incubare a 37 ° C per 72 ore. Rimuovere medie e incubare con terreno fresco per 24 ore. Iniziare selezione di cellule trasdotte aggiungendo blasticidin al mezzo di coltura (5 mg / ml) e monitor per eritrociti mediante microscopia in fluorescenza (Figura 1). </li></ol></li><li> Coltivare le cellule RFP-tag in media ID8 di semina di circa 10 6 cellule in un piatto di coltura tissutale e la visualizzazione di tutti i giorni utilizzando un microscopio ottico fino a quando il monostrato cellulare è confluenti. </li><li> Quando confluenti, raccogliere le cellule con tripsina (0,25%, 3 min) e riportare il pallone al incubatore a 37 o fino a quando le cellule sono staccati. </li><li> Neutralizzare la tripsina con 6 ml di mezzo di coltura contenente siero ID8. Pipettare su e giù contro il fondo del piatto, poi trasferire in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 1200 rpm per 2 minuti, quindi aspirare il mezzo utilizzando un glass pipetta. </li><li> Lavare le cellule con tampone fosfato (PBS) per risospendere delicatamente in 6 ml di caldo PBS e centrifugazione come in 1.5 sopra. Risospendere in PBS ad una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule / ml. Mantenere le cellule calde (37 ° C) fino a iniezione. </li></ol> 2. iniezione intra-peritoneale di cellule ID8 e in vivo Imaging <ol><li> Iniettare ogni topo con 2 mL di soluzione calda ID8-PBS per un totale di 10 milioni di cellule attraverso (ip) iniezione intra-peritoneale. Consentono alle cellule tumorali di crescere in vivo per circa 10 settimane con l&#39;imaging dal vivo ogni settimana. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;iniezione e ogni settimana da allora in poi, pesare i topi e poi anestetizzare ogni topo usando isofluorane (portata 2,5% in O 2 flusso di 0,5 l / min). Nota: I topi sono stati pesati, non come una misura quantitativa della massa tumorale, ma piuttosto una misura più generale dell topo progressione fisica durante lo studio. I topi pesanots sono stati confrontati con i propri valori di peso precedenti. <ol><li> Anestetizzare topi mettendo in una camera isofluorane. Mantenere l&#39;anestesia costanti durante la scansione posizionando la testa del mouse nel naso-cono per l&#39;esposizione al 2,5% isofluorane portata durante tutta la procedura. </li></ol></li><li> Usare una crema depilatoria per rimuovere i peli sul torace e dell&#39;addome di ogni topo, come i capelli neri causerà attenuazione del segnale di fluorescenza. I topi sono bagnate con acqua calda dopo applicazione della crema depilatoria e asciugati con carta assorbente RT. </li><li> Mentre anestetizzato, scansione dell&#39;intero corpo di ciascun topo usando un piccolo sistema di imaging ottico animale. Scansione di tutti i topi in una coorte in ogni punto. Utilizzare i seguenti due step protocollo (Figura 2A): <ol><li> Nel passaggio 1, per osservare fluorescente (RFP), le cellule tumorali, eseguire l&#39;acquisizione multispettrale a raccogliere un totale di 5 immagini utilizzando filtri di eccitazione di 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm e 540 nm, ed un filtro di emissione di 600 nm. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione: un&#39;esposizione standard di 15 sec, 2 x 2 binning, FOV di 160 mm, e f arresto di 1.1. </li><li> Al punto 2, per osservare l&#39;intero animale, acquisire un&#39;immagine di riflessione utilizzando un filtro aperto di eccitazione (luce bianca), un filtro di emissione aperto, un&#39;esposizione standard di 0,2 sec con 2 x 2 binning e un FOV di 16 cm. Nota: Il tempo di imaging attuale è ~ 1 min. </li></ol></li></ol> 3. mouse dissezione e Image Acquisition <ol><li> Quando l&#39;imaging dal vivo mostra la presenza di una lunga malattia intraperitoneale o animali accumulo mostra di ascite (come evidenziato da distensione addominale), la perdita o il guadagno di peso corporeo superiore al 20%, letargia o altri segni di sofferenza, eutanasia ogni mouse utilizzando CO 2 anestesia seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Tagliare la pelle anteriormente lungo la linea mediana ventrale del mouse, utilizzando dissectio appuntiton forbici, dalla parte superiore delle cosce alla parte inferiore della gabbia toracica. Prestare la massima attenzione a tagliare solo lo strato di pelle (Figura 2BI). separare delicatamente la pelle dal tessuto peritoneale, facendo attenzione a non forare la parete peritoneale. </li><li> Utilizzando forbici dissezione appuntiti, tagliati lateralmente sia lungo la parte inferiore della gabbia toracica e la parte superiore delle cosce per creare due lembi di pelle (Figura 2B ii, iii). </li><li> Posizionare ogni mouse sul lato ventrale (cavità peritoneale rivolta verso il basso) con i lembi cutanei tirato aperta e scansione ogni topo con i suoi organi in situ utilizzando il piccolo sistema di imaging ottico animale (Figura 3A, B). <ol><li> Utilizzare gli stessi parametri di acquisizione di immagini, come descritto nella 2.4.1.-2.4.2. </li></ol></li><li> Continuare a sezionare il mouse con l&#39;estrazione di singoli organi peritoneali tra cui il fegato, omento / pancreas, stomaco, il diaframma, intestino tenue, intestino crasso, a sinistra ea destra del peritoneo, ovaie, kidneys, mesentere e cuscinetto adiposo. <ol><li> Osservare, enumerare, e registrare i tumori visibile in ogni organo. Utilizzare un calibro per misurare il diametro di ciascun tumore. </li><li> Designare tumori meno di 2 mm di diametro più piccolo, tra 2 e 5 mm come media e maggiore di 5 mm più grande. </li></ol></li><li> Posizionare gli organi sul modello di scansione organo (figura 4) che identifica una posizione predeterminata per ogni organo. Utilizzare PBS per mantenere gli organi umido. </li><li> Scansione ogni foglio di organi utilizzando il piccolo sistema di imaging ottico animale (Figura 3C, D). <ol><li> Utilizzare gli stessi parametri di acquisizione di immagini come descritto al punto 2.4. </li></ol></li><li> Dopo la scansione, luogo organi in formaldeide al 10% per consentire la successiva lavorazione per l&#39;esame istologico. </li></ol> 4. Quantificazione del carico tumorale in thImmagini e fluorescenza <ol><li> Al fine di ridurre la quantità di auto-fluorescenza ogni scansione multispettrale, prima unmix i file utilizzando software disponibile con il piccolo sistema di imaging animali. <ol><li> Caricare prima la richiesta di offerta: Nel file di spettrale Vivo, seguito dal Autofluor: Nel file di Vivo rosso nella finestra non miscelati Immagini e selezionare Unmix. </li></ol></li><li> Esportare i file in formato .bip 16 bit .tiff (non in scala). </li><li> Utilizzare il software ImageJ (ex vivo organi e poi il corpo pieno mouse con organi in situ). <ol><li> Utilizzare File&gt; Apri per aprire i file TIFF a 16 bit dei file di modello di scansione organo in ImageJ. </li><li> Sotto Immagine&gt; Regola&gt; Luminosità / Contrasto, scegliere di impostare il minimo valore visualizzato a 0 e il massimo valore visualizzato a 35.353 e poi sottoImmagine&gt; tabelle di ricerca, selezionare Red Hot. Nota: I vari modelli animali saranno richiedono diversi livelli di luminosità, ma è importante per mantenere la luminosità costante durante un determinato studio. </li><li> Utilizzando lo strumento Selezione a mano libera, disegnare una regione a forma libera di selezione interesse (ROI) intorno ad ogni organo e utilizzare lo strumento di misura (CTRL + M) per calcolare la superficie di ciascun organo; registrare la superficie di ogni organo in un foglio di calcolo. </li><li> Con il ROI disegnato attorno ad ogni organo, fate clic destro all&#39;interno del ROI e selezionare Duplica per includere solo l&#39;organo. </li><li> Guardando il singolo organo, sotto Immagine&gt; Regola&gt; Soglia, scegliere di impostare la soglia di immagine ad un più basso livello di soglia del + 1200 ed una soglia di livello superiore della + 1700 per selezionare only regioni più luminose fluorescenti e di controllo per selezionare sfondo scuro; selezionare OK. Nota: Le immagini possono richiedere manipolazione manuale dei cursori di soglia in ImageJ modo che le aree precedentemente brillanti sono selezionati per la fase di analisi, come mostrato sopra. Diversi modelli di malattia saranno richiedono diversi vincoli di soglia, ma è importante per mantenere i livelli di soglia costanti durante un determinato studio. </li><li> Sotto Analizza&gt; Analisi Particelle, modificare la dimensione (pixel ^ 2) a 10-Infinity, scegliere di visualizzare: contorni, di controllo per selezionare solo &quot;Risultati&quot; e fare clic su OK per misurare sia le aree e densità prime integrati di queste regioni luminose, tumori considerati. </li><li> Registrare i valori della superficie e la densità di Raw integrato di ogni selezione del tumore visualizzato nel <sTrong&gt; tabella Risultati nello stesso foglio di calcolo contenente le superfici d&#39;organo. </li><li> Sotto Analizza&gt; Strumenti&gt; Calibrazione Bar, aggiungere una barra di scala di calibrazione per le immagini degli organi. Nota: In questo esempio, questo è stato fatto cambiando la posizione di alto a destra, il colore di riempimento al nero, il colore dell&#39;etichetta di bianco, il numero di etichette a 5, le cifre decimali a 0, la dimensione del carattere a 12 e la Zoom fattore a 4,0 e consentendo testo in grassetto. </li><li> Sotto File&gt; Salva con nome ..., salvare il montaggio come .tiff e .jpeg. </li><li> Utilizzare File&gt; Apri per aprire il file .jpeg degli organi e poi sotto Inserisci&gt; Casella di testo </strong&gt;, aggiungere etichette organo creando una casella di testo sotto ciascuna delle tre file di organi. </li><li> Utilizzare File&gt; Apri per aprire ciascuno dei file TIFF a 16 bit delle scansioni corpo pieno in ImageJ in ordine di numero di mouse. </li><li> Sotto Immagine&gt; Regola&gt; Luminosità / Contrasto, scegliere di impostare il minimo valore visualizzato 0 e il massimo valore visualizzato a + 35353 e poi sotto Immagine&gt; tabelle di ricerca, selezionare Red Hot. </li><li> Sotto File&gt; Salva con nome ..., salvare il montaggio come. Tiff e .jpeg. </li></ol></li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Aggiungere le aree di selezione tumorali e densità integrati prime, rispettivamente, per ogni organo di ciascun topo e registrare la superficie totale tumorale organo per ogni mouse. </li><li> Normalizzare l&#39;area registrata e integrat primevalori di densità ED per la dimensione di ciascun organo dividendo l&#39;area tumorale totale e valori di densità integrati prime totale dalla corrispondente superficie dell&#39;organo (Tabella 1). </li><li> Calcolare e tracciare la media di entrambe le superfici del tumore normalizzati ei valori di densità integrati prime normalizzati (Figura 5A, B). </li><li> Confrontare questi valori medi a quelli ottenuti contando visivamente i tumori che erano visibili ad occhio nudo durante l&#39;ispezione di ogni organo per lesioni metastatiche. </li></ol>

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Questo articolo fa parte di un numero speciale su Imaging multimodale pre-clinico, sponsorizzato da Bruker Biospin.

In contrasto con gli studi utilizzando cellule di cancro ovarico umano che devono essere condotti in topi immunocompromessi, il protocollo sopra descritto utilizza topi immunocompetenti C57 / BL6 e le cellule di cancro ovarico murini singenici. Mentre questo consente di valutare il ruolo potenziale di infiltrati immunitari in progressione tumorale e metastasi, la presenza di peli scuri sulla superficie addominale rende meno sensibili di imaging. Uso di un depilatoria per rimuovere i capelli prima di imaging migliora l&#...

Cancro ovarico epiteliale (EOC) è la più comune causa di morte per neoplasia ginecologica, con una stima di 21,290 nuove diagnosi negli Stati Uniti nel 2015 e si stima che 14.180 decessi 1. La stragrande maggioranza (&gt; 75%) delle donne con diagnosi di malattia in stadio avanzato (stadio III o IV) caratterizzata da diffuse metastasi intra-peritoneale e prognosi infausta. Recidiva di malattia nella cavità peritoneale dopo chemioterapia di prima linea è comune e rappresenta una delle principali cause di mortalità 2,3. EOC metastatizza da un unico meccanismo che coinvolge sia diretta estensione dal tumore primario agli organi peritoneali vicini così come per dissociazione o spargimento di cellule dalla superficie del tumore primario come singole cellule o aggregati multicellulari. Le cellule sono capannone nella cavità peritoneale, in cui resistono distacco indotta l&#39;apoptosi 4. Accumulo di ascite peritoneale è comune, come le cellule tumorali capannone bloccare il drenaggio linfatico peritoneale e tumors producono fattori di crescita che alterano la permeabilità vascolare. Una porzione di cellule tumorali capannone attaccare alla superficie degli organi peritoneali e strutture compreso intestino, fegato, omento e mesentere, dopo di che ancorano e proliferano per produrre più lesioni secondarie ampiamente diffusi 3,5. metastasi ematogena è raro. Così, gestione clinica comunemente è costituito da chirurgia citoriduttiva tra cui &quot;debulking ottimale&quot;, definita come la resezione di tutto tumore visibile (non importa quanto piccolo). Citoriduzione completa è associato ad un significativo aumento della sopravvivenza totale 6,7 ed è associato con la sfida di identificazione e la rimozione delle lesioni &lt;0,5 cm. modelli piccoli animali hanno dimostrato l&#39;utilità nella ricerca sul cancro ovarico nel migliorare la nostra comprensione della progressione della malattia, nonché l&#39;identificazione di biomarcatori prognostici e la sperimentazione di nuovi chemioterapie o approcci di terapia di combinazione. Come il primariosito di incidenza del cancro ovarico e metastasi è la cavità peritoneale, modelli ortotopici di EOC metastasi coinvolgono l&#39;analisi e la caratterizzazione della malattia intraperitoneale. Anche se ci sono stati i recenti miglioramenti nella capacità di cellule tumorali immagine, anche a livello di singola cellula, esistono ancora notevoli difficoltà nel quantificare il carico tumorale metastatico del EOC. Queste sfide si presentano a causa del numero, le dimensioni e la localizzazione anatomica delle lesioni metastatiche. Inoltre esiste una necessità di cellule tumorali etichetta per distinguerli dai normali cellule ospiti. Studi precedenti hanno utilizzato protocolli di etichettatura a base di anticorpi o trasfezione di cellule tumorali con luciferasi 8,9. Etichettatura diretta fluorescente delle cellule tumorali è stato segnalato da Chishima e collaboratori nel 1997 10. Etichette fluorescenti non richiedono aggiunta di substrato esogeno e di offrire una piacevole specificità delle cellule tumorali, fornendo un mezzo più efficace per tenere traccia delle metastasi del cancro 11,12 </sup&gt;. Qui si descrive un metodo di imaging ottico per l&#39;analisi quantitativa della malattia metastatica utilizzando un modello di xenotrapianto ortotopico singenici composta da proteina fluorescente rossa (RFP) -tagged murine ID8 cellule di cancro ovarico 13 e topi C57 / BL6 immuno-competenti. Abbiamo dimostrato un nuovo metodo di relativa carico tumorale quantificazione combinando in vivo ed ex vivo l&#39;imaging con rimozione del tessuto auto-fluorescenza. Questo approccio ha potenziale utilità in studi volti a valutare l&#39;effetto di specifici genetica, epigenetica o microambientali modifiche e / o modalità di trattamento sulla metastasi organo-specifiche di cancro ovarico.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Corning</td><td>10-014-CM</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement</td><td>Sigma</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Xtreme small animal imaging system</td><td>Bruker Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Multispectral software</td><td>Bruker Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lentiviral particles with Red fluorescent protein</td><td>GenTarget, Inc.</td><td>LVP023</td><td></td></tr><tr><td>trypsin for cell culture</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)</td><td>purchases from drugstore&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software&amp;nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/&amp;nbsp;</td><td></td><td>free download</td></tr><tr><td>dissecting tools (forceps)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>&amp;nbsp;RS 5130</td><td></td></tr><tr><td>dissecting tools (Scissors)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS 5910</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Il meccanismo metastatico del cancro ovarico è caratterizzato da altamente diffusa metastasi intraperitoneale composto da numerose lesioni di varie dimensioni, tra cui più di piccole dimensioni (&lt;2 mm) lesioni. Pertanto, l&#39;uso di cellule tumorali RFP marcato (Figura 1) e l&#39;imaging ottico fornisce un metodo alternativo per conteggio manuale e la misurazione delle dimensioni della lesione. Lo sviluppo della massa tumorale nel tempo può essere determinata sett...

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Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K Views.  University of Notre Dame. Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

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An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all gynecologic malignancies among US women 1,2,3. Serous tumors are the most widespread forms of ovarian cancer and 4,5 the Tg-MISIIR-TAg transgenic represents the only mouse model that spontaneously develops this type of tumors. Tg-MISIIR-TAg mice express SV40 transforming region under control of the Mullerian Inhibitory Substance type II Receptor (MISIIR) gene promoter 6. Additional transgenic lines have been identified that express the SV40 TAg transgene, but do not develop ovarian tumors. Non-tumor prone mice exhibit typical lifespan for C57Bl/6 mice and are fertile. These mice can be used as syngeneic allograft recipients for tumor cells isolated from Tg-MISIIR-TAg-DR26 mice.
Objective: Although tumor imaging is possible 7, early detection of deep tumors is challenging in small living animals. To enable preclinical studies in an immunologically intact animal model for serous ovarian cancer, we describe a syngeneic mouse model for this type of ovarian cancer that permits in vivo imaging, studies of the tumor microenvironment and tumor immune responses.
Methods: We first derived a TAg+ mouse cancer cell line (MOV1) from a spontaneous ovarian tumor harvested in a 26 week-old DR26 Tg-MISIIR-TAg female. Then, we stably transduced MOV1 cells with TurboFP635 Lentivirus mammalian vector that encodes Katushka, a far-red mutant of the red fluorescent protein from sea anemone Entacmaea quadricolor with excitation/emission maxima at 588/635 nm 8,9,10. We orthotopically implanted MOV1Kat in the ovary 11,12,13,14 of non-tumor prone Tg-MISIIR-TAg female mice. Tumor progression was followed by in vivo optical imaging and tumor microenvironment was analyzed by immunohistochemistry.
Results: Orthotopically implanted MOV1Kat cells developed serous ovarian tumors. MOV1Kat tumors could be visualized by in vivo imaging up to three weeks after implantation (fig. 1) and were infiltrated with leukocytes, as observed in human ovarian cancers 15 (fig. 2).
Conclusions: We describe an orthotopic model of ovarian cancer suitable for in vivo imaging of early tumors due to the high pH-stability and photostability of Katushka in deep tissues. We propose the use of this novel syngeneic model of serous ovarian cancer for in vivo imaging studies and monitoring of tumor immune responses and immunotherapies.

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

To study in vivo tumor growth and tumor microenvironment, we used a syngeneic and orthotopic mouse model of ovarian cancer in immunocompetent animals. We transduced a mouse tumor cell line (MOV1) with Katushka fluorescent protein (MOV1KAT) and here we show its orthotopic implantation in ovary and in vivo imaging.

Un modello ortotopico di carcinoma ovarico sieroso in topi immunocompetenti per In vivo Tumore Imaging e monitoraggio del tumore Risposte immunitarie

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic spread has already occurred. However, ovarian cancer has a unique pattern of metastatic spread, in that tumor implants are initially contained within the peritoneal cavity. This feature could enable, in principle, the complete resection of tumor implants with curative intent. Many of these metastatic lesions are microscopic, making them hard to identify and treat. Neutralizing such micrometastases is believed to be a major goal towards eliminating tumor recurrence and achieving long-term survival. Raman imaging with surface enhanced resonance Raman scattering nanoprobes can be used to delineate microscopic tumors with high sensitivity, due to their bright and bioorthogonal spectral signatures. Here, we describe the synthesis of two &#39;flavors&#39; of such nanoprobes: an antibody-functionalized one that targets the folate receptor &#8212; overexpressed in many ovarian cancers &#8212; and a non-targeted control nanoprobe, with&#160;distinct spectra. The nanoprobes are co-administered intraperitoneally to mouse models of metastatic human ovarian adenocarcinoma. All animal studies were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The peritoneal cavity of the animals is surgically exposed, washed, and scanned with a Raman microphotospectrometer. Subsequently, the Raman signatures of the two nanoprobes are decoupled using a Classical Least Squares fitting algorithm, and their respective scores divided to provide a ratiometric signal of folate-targeted over untargeted probes. In this way, microscopic metastases are visualized with high specificity. The main benefit of this approach is that the local application into the peritoneal cavity &#8212; which can be done conveniently during the surgical procedure &#8212; can tag tumors without subjecting the patient to systemic nanoparticle exposure. False positive signals stemming from non-specific binding of the nanoprobes onto visceral surfaces can be eliminated by following a ratiometric approach where targeted and non-targeted nanoprobes with distinct Raman signatures are applied as a mixture. The procedure is currently still limited by the lack of a commercial wide-field Raman imaging camera system, which once available will allow for the application of this technique in the operating theater.

Ovarian cancer forms metastases throughout the peritoneal cavity. Here, we present a protocol to make and use folate-receptor targeted surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobes that reveal these lesions with high specificity via ratiometric imaging. The nanoprobes are administered intraperitoneally to living mice, and the derived images correlate well with histology.

Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Ricerca sul cancro

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Medicina

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

Modello murino per l&#39;imaging non invasivo per rilevare e monitorare Ovarian Cancer Ricorrenza

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Stabilire un modello 3D ex vivo per l'interazione cancro ovarico-omento

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian cancer cells as well as immune modulatory signals that allow tumor tolerance. However, we have limited models that closely mimic the interaction between ovarian cancer cells and adipose-rich tissues. To further understand the cellular and molecular mechanisms by which the omentum provides a pro-tumoral microenvironment, we developed a unique 3D ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. Using human omentum, we are able to grow ovarian cancer cells within this adipose-rich microenvironment and monitor the factors responsible for tumor growth and immune regulation. In addition to providing a platform for the study of this adipose-rich tumor microenvironment, the model provides an excellent platform for the development and evaluation of novel therapeutic approaches to target metastatic cancer cells in this niche. The proposed model is easy to generate, inexpensive, and applicable to translational investigations.

Autore in primo piano: Modello avanzato ex vivo per lo studio dell'interazione cancro-microambiente adiposo 

This protocol describes the establishment of a three-dimensional (3D) ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. The model provides a platform for elucidating pro-tumor mechanisms within the adipose niche and for testing novel therapies.

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

Riepilogo

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Un modello ortotopico di carcinoma ovarico sieroso in topi immunocompetenti per In vivo Tumore Imaging e monitoraggio del tumore Risposte immunitarie

Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l'invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Modello murino per l'imaging non invasivo per rilevare e monitorare Ovarian Cancer Ricorrenza

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo