Per iniziare, genera assembloidi marcati con virus utilizzando organoidi cerebrali specifici per il destino. Per preparare i reagenti per il pretrattamento superficiale MEA, sciogliere 0,5 grammi di polvere enzimatica detergente in 50 millilitri di acqua deionizzata. Agitare accuratamente la miscela fino a quando la polvere non è completamente disciolta e sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro sottovuoto sterile all'interno della cappa di biosicurezza.
Diluire 500 microlitri di polietilenimmina al 7% o soluzione madre di PEI con 49,5 millilitri di tampone borato 1X per preparare una soluzione di PEI allo 0,07%. Per sterilizzare la soluzione, filtrarla attraverso un'unità filtrante da 0,22 micrometri all'interno della cabina di biosicurezza. Quindi, erogare un millilitro della soluzione enzimatica detergente all'1% in ciascun pozzetto di una piastra MEA sterile e incubarla a 37 gradi Celsius per due ore.
Quindi rimuovere la soluzione enzimatica detergente da ciascun pozzetto e lavare i pozzetti cinque volte con 1,5 millilitri di acqua deionizzata sterile per pozzetto. Riempire ogni pozzetto con un millilitro di terreno di coltura per il precondizionamento. Rimetti le piastre MEA in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per due giorni.
Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti e aggiungere 50 microlitri di soluzione di PEI allo 0,07% per coprire gli elettrodi MEA per il rivestimento primario. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi aspirare completamente la soluzione di PEI da ciascun pozzetto.
Lavare ogni pozzetto tre volte con un millilitro di acqua deionizzata sterile. Dopo aver aspirato l'acqua, asciugare le piastre a temperatura ambiente per 15 minuti nella cabina di biosicurezza con il coperchio aperto. Coprire ora l'area dell'elettrodo in ciascun pozzetto con 50 microlitri di matrice a membrana basale da uno a 20 da volume a volume diluita in terreno di coltura per il rivestimento secondario.
Riposizionare le piastre MEA nell'incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aspirare la soluzione di matrice diluita, lasciando uno strato sottile sulla superficie. Se si forma uno strato spesso, spruzzare con forza l'area di contatto dell'elettrodo con un terreno di coltura utilizzando un puntale per pipetta P1000.
Quindi, utilizzando una punta P1000 con un taglio largo, raccogliere un assembloide dal piatto e posizionarlo con cura sopra gli elettrodi in un pozzetto, trasferendo il minor numero possibile di fluidi. Posizionare la piastra al microscopio da dissezione in una cappa a flusso laminare e, utilizzando una punta sterile P 20, spingere con cautela l'assembloide nella posizione desiderata. Utilizzare una punta P 20 per rimuovere il liquido in eccesso attorno all'assembloide.
Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra dall'incubatrice. Quindi, osservando al microscopio da dissezione, applicare due o tre piccole gocce di matrice di membrana basale da una a 50 diluite in terreno di coltura sopra gli assembloidi e rimettere la piastra nell'incubatore per altri 30 minuti. Successivamente, aggiungere con cura tre gocce di terreno di coltura vicino agli assembloidi utilizzando un microscopio da dissezione.
Il giorno successivo, controlla se gli assembloidi si sono depositati e stabilizzati al microscopio da dissezione. Aggiungere 750 microlitri di terreno di coltura per portare il volume totale a un millilitro per pozzetto e lasciare la piastra indisturbata per almeno due giorni nell'incubatore. Ogni settimana, rimuovere con cura 500 microlitri di terreno di coltura da ciascun pozzetto e introdurre 700 microlitri freschi di terreno basale neurofisiologico in ciascun pozzetto.
Il giorno 92 è stato osservato un aumento della durata del bursting della rete rispetto al giorno 78, probabilmente a causa della maturazione dei neuroni. L'attività cellulare e di rete è lentamente svanita entro il giorno 125.
