La tecnica che presentiamo oggi consente l'analisi dell'attività dei neuroni del midollo spinale come risultato del fattore neuronale intrinseco e dell'influenza degli astrociti circostanti. Questa tecnica genera in modo affidabile sia i neuroni umani che gli astrociti umani che sono specifici del midollo spinale e utilizza una misura di output funzionale che può essere scalata per la riproducibilità. La tecnica che presentiamo consente di studiare malattie specifiche dei neuroni del midollo spinale come la sclerosi laterale amiotrofica, utilizzando neuroni di pazienti con malattie sporadiche o genetiche.
Per cominciare, esaminare le placche iPSC umane per colonie sufficientemente dense in modo tale che il centro delle colonie mostri aree bianche sparse. Quindi, per iniziare a confezionare le celle, disegna linee della griglia sulla superficie esterna inferiore delle piastre con un pennarello per facilitare una copertura accurata dell'intera piastra. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 10x in una cappa di coltura per staccare le colonie differenziate raschiando manualmente con una punta di pipetta da 200 microlitri.
Quindi, sciacquare le piastre due volte con PBS. E poi aggiungere cinque millilitri di proteasi di dissociazione tissutale preriscaldata a 37 gradi Celsius. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro-sette minuti fino a quando i bordi delle colonie iniziano ad arrotondarsi, prima di sollevare le colonie dalla piastra.
Aspirare con cura la proteasi di dissociazione e sciacquare delicatamente la piastra due volte con PBS senza rimuovere le colonie. Aggiungere cinque millilitri di terreno iPSC umano preriscaldato alla piastra di coltura. Quindi grattare l'intera piastra con una punta di una pipetta da cinque millilitri usando un movimento avanti e indietro dall'alto verso il basso e sollevare le colonie mentre le si rompe in aggregati cellulari più piccoli.
Per la differenziazione di iPSC umane in cellule progenitrici neurali. Una volta che l'iPSC umana forma un monostrato e diventa confluente al 90%, inizia la differenziazione come descritto nel manoscritto. Il 12 ° giorno, dopo il trattamento con tripsina, se le cellule non sono in sospensione, le cellule si staccano meccanicamente espellendo il mezzo di induzione neurale da una punta di pipetta da 1000 microlitri sulle cellule con un movimento circolare per coprire l'intera superficie.
Se le colture cellulari progenitrici neurali sono state congelate, scongelarle. Dopo lo scambio del mezzo e il risciacquo PBS come descritto nel manoscritto, cambiare il mezzo con un mezzo di differenziazione dei motoneuroni contenente 0,02 micromolari citosina arabinoside, quindi incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica quando i progenitori gliali impegnati emergono come singole cellule piatte proliferanti sotto progenitori post mitotici del motoneurone, aggregati in cluster di cellule. Successivamente, eseguito lo scambio di mezzo come indicato nel manoscritto.
Il giorno della placcatura o prima, iniziare a rivestire le lastre MEA a 24 pozzetti diluendo prima PLO in acqua o PBS. Quindi aggiungere da 15 a 20 microlitri di PLO a ciascun pozzetto formando una goccia al centro del pozzetto, coprendo l'area dell'elettrodo assicurandosi di non danneggiare gli elettrodi con la punta della pipetta. Aggiungere acqua ai compartimenti che circondano i pozzi, garantendo un'umidità sufficiente.
E incubare l'OLP a 37 gradi Celsius per una o due ore. Quindi, utilizzando una punta di micro pipetta di plastica, aspirare il più possibile PLO senza toccare gli elettrodi. Quindi, lavare il pozzo con 250 microlitri di acqua tre volte.
Utilizzando una punta per pipetta, rimuovere quanta più acqua possibile e lasciare asciugare la superficie rimuovendo il coperchio. Quindi, aggiungere da 15 a 20 microlitri di laminina diluita per coprire ciascun array di elettrodi. Dopo aver aggiunto acqua ai compartimenti di umidità e sostituito il coperchio, incubare a 37 gradi Celsius per un minimo di due ore fino a tutta la notte.
Il giorno della placcatura, dopo aver sciacquato i motoneuroni e le colture di astrociti una volta con PBS, aggiungere lo 0,05% di tripsina e incubare a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti per sollevare le cellule. Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 millilitri contenente inibitore della tripsina. E lavare le piastre con mezzo o base per garantire che tutte le celle siano raccolte.
Pellet lungo le cellule per centrificazione. E poi usando una pipetta da 1000 microlitri, risospendere i motoneuroni e gli astrociti con un mezzo di co-coltura contenente 20 micromolari di inibitore ROCK per generare un millilitro di una sospensione di una singola cellula. Utilizzando un emocitometro, contare i motoneuroni e gli astrociti.
E mentre contava, teneva le sospensioni delle celle e le metteva in una griglia di polistirolo a quattro gradi Celsius. Centrifugare un millilitro di entrambe le sospensioni cellulari a 300 volte G per cinque minuti. Calcola il volume desiderato e risospendi il pellet.
Combinare il volume richiesto di sospensioni di neuroni e astrociti in proporzioni uguali e mescolare delicatamente pipettando due volte per combinare accuratamente. Quindi rimuovere la laminina da ciascun pozzetto della piastra e trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare combinata finale a ciascun pozzetto, formando una piccola goccia che copre l'array di elettrodi. Incubare le piastre con una goccia di cellula indisturbata a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti per formare attacchi iniziali sulle piastre.
Quindi pipettare 250 microlitri di terreni di co-coltura caldi contenenti inibitore ROCK sulla parete di ciascun pozzetto e pipettare lo stesso volume sulla parete opposta di ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24-36 ore. Il giorno dopo, esamina le piastre per detriti o cellule morte. E, se necessario, scambiare il terreno con un terreno di coltura fresco contenente inibitore ROCK.
Altrimenti, eseguire scambi di mezzo mezzo due volte alla settimana utilizzando un terreno di co-coltura senza un inibitore ROCK a partire dal secondo giorno di co-coltura. Per eseguire la registrazione, iniziare il prima possibile dopo il primo giorno di co-coltura impostando la temperatura a 37 gradi Celsius e l'anidride carbonica al 5%, quindi trasferire le piastre alla macchina di registrazione ed equilibrare per almeno cinque minuti prima della registrazione. Registra l'attività di base a giorni alterni o settimanalmente da uno a 15 minuti a seconda del disegno sperimentale.
Per studiare gli effetti elettrofisiologici transitori dei composti che colpiscono i neuroni o gli astrociti, rimuovere il coperchio della piastra ma tenere chiuso il coperchio della macchina e registrare l'attività basale per almeno un minuto. Aprire manualmente il coperchio della macchina senza interrompere la registrazione elettrofisiologica e scambiare 25 microlitri di mezzo con il veicolo farmacologico appropriato. Quindi chiudere manualmente il coperchio e registrare per ulteriori minuti, se necessario.
Allo stesso modo, testare il farmaco di interesse. In questo protocollo, le hiPSC sono state mantenute e fatte passare come colonie non confluenti. La neurogenesi è stata iniziata attraverso la doppia inibizione della SMAD inattivando le vie BMP e TGF-beta.
Le cellule staminali neuroepiteliali risultanti si sono divise e hanno generato un epitelio multistrato. L'esposizione precoce ai fattori di crescita neuronali e a un fattore neurotrofico ciliare gliogenico ha generato una popolazione mista di cellule progenitrici. I neuroni sono emersi spontaneamente da questa popolazione mista.
Lo switch gliogenico ha indotto la differenziazione degli astrociti attraverso l'attivazione della via JAK-STAT. L'identità del midollo spinale delle cellule del motoneurone trattate con inibitori di notch e differenziate è stata supportata da alti livelli di espressione della colina acetiltransferasi. Il 90° giorno dopo la coltura in vitro, gli astrociti iPSC umani hanno mostrato un fenotipo maturo come indicato dall'espressione di S100 beta e GFAP, mentre la loro identità regionale del midollo spinale era supportata dall'espressione di falchi in precedenza.
Le cellule co-coltivate si sono riorganizzate spontaneamente con gli astrociti creando uno strato di alimentazione nella parte inferiore e neuroni che collegano le reti nella parte superiore. I neuroni si sono aggregati in grandi gruppi di cellule quando coltivati da soli, mentre la co-coltura di motoneuroni iPSC umani con astrociti iPSC umani ha portato a monostrati uniformemente distribuiti. Gli astrociti iPSC umani hanno migliorato la maturazione elettrofisiologica dei motoneuroni iPSC umani, come dimostrato da gradi più elevati di attività di spiking e bursting nelle co-colture.
Nella nostra esperienza, la coltura di cellule staminali e la differenziazione precoce degli NPC sono le più difficili e sensibili agli errori tecnici. In questa fase, le tecniche non devono essere eseguite con coerenza e accuratezza con poco margine per la risoluzione dei problemi. Le tecniche di co-coltura qui descritte possono essere utilizzate anche in altri modelli specifici di tipo cellulare.
