Per iniziare, rimuovi le fiale di seta FN dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e mettile nel ghiaccio secco per il trasporto. Portare le fiale in una cabina di sicurezza biologica e posizionarle in un rack per provette da microcentrifuga. Dopo lo scongelamento, pipettare 550 microlitri di soluzione di seta in ogni secondo pozzetto di una piastra a 48 pozzetti.
Metti il coperchio sul piatto e mettilo all'interno di una scatola sterile. Trasferire con cura la scatola dalla cabina di sicurezza biologica e lasciarla in condizioni ambientali per una notte. Il giorno successivo, portare la scatola contenente la piastra con le membrane FN-seta e gli inserti sterili nella cabina di sicurezza biologica.
Sollevare con cautela la piastra dalla scatola, aprire il coperchio della piastra e verificare visivamente la formazione della membrana osservando l'intorbidamento nei pozzetti. Usando una pinzetta sterile, prendi un inserto e guidalo verso il basso sulla membrana finché i manici non toccano la parte superiore del pozzetto. Una volta che tutti gli inserti sono stati abbassati, posizionare il coperchio sulla piastra e rimettere la piastra nella scatola sterile.
Lasciare che le membrane aderiscano agli inserti per due ore. Quindi, rimuovi il piatto dalla scatola e apri il coperchio. Utilizzando una pinzetta sterile, rimuovere l'inserto dal pozzetto.
Riempire l'inserto con 100 microlitri di DMEM/F12 per la semina basale o 200 microlitri per la semina apicale. Trasferire l'inserto in un pozzetto vuoto di una piastra a 24 pozzetti e riempire il pozzetto con un millilitro di DMEM/F12. Dopo aver raccolto il numero desiderato di cheratinociti umani, utilizzando una pipetta P200, aspirare da 20 a 50 microlitri di sospensione cellulare.
Puntare la punta della pipetta verso il centro della membrana e premere lentamente lo stantuffo della pipetta, portando la gocciolina a contatto con il terreno di coltura all'interno dell'inserto. Una volta trasferite tutte le membrane, spostare la piastra a forma di otto per distribuire uniformemente le cellule sulle membrane. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Usando una pinzetta, sollevare gli inserti dalla piastra a 24 pozzetti, lasciando il terreno di coltura nei pozzetti. Quindi capovolgere l'inserto in modo che il lato basale sia rivolto verso l'alto. Posizionare l'inserto capovolto nella capsula di Petri.
Aspirare 20 microlitri della sospensione di cellule di cheratinociti umani risospese con una pipetta P200. Puntare la punta della pipetta verso il centro della membrana e premere lentamente lo stantuffo della pipetta per formare una gocciolina che cade sulla membrana. Metti il coperchio sulla capsula di Petri.
Trasferire la piastra di Petri e la piastra a 24 pozzetti contenente il terreno nell'incubatore per 30 minuti. Dopo l'incubazione, portare la piastra a 24 pozzetti e la piastra di Petri nella cabina di sicurezza biologica. Usando una pinzetta, prendi un inserto e capovolgilo in modo che il lato apicale della membrana sia rivolto verso l'alto e il lato basale verso il basso.
Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura all'interno dell'inserto. Riposizionare l'inserto in un pozzetto preriempito della piastra a 24 pozzetti. Coltivare gli inserti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
I cheratinociti coltivati sulla membrana FN-seta coprivano uniformemente la superficie e mostravano una morfologia a ciottoli il primo giorno. I cheratinociti formavano uno strato confluente entro il terzo giorno, indicando la funzione epiteliale, e formavano una rete di giunzioni strette che indicavano che stavano assumendo funzioni epiteliali fisiologiche. Dopo tre giorni è stata osservata un'elevata vitalità cellulare attraverso le membrane FN-seta, senza differenze significative nella vitalità tra il centro e la periferia.
Il sistema a membrana FN-seta ha supportato la vitalità dei cheratinociti in modo simile o migliore rispetto ai sistemi a membrana in PET commerciali.
