Per iniziare, raccogli le piantine di Columbia-0 Arabidopsis congelate e non trattate di cinque giorni nel contenitore dell'azoto liquido. Macinare le piantine con un omogeneizzatore in polvere per un minuto. Quindi aggiungere 500 microlitri di tampone di estrazione dei polisomi alla provetta.
Capovolgere e agitare il tubo per miscelare il campione. Centrifugare la soluzione di estrazione a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, filtrare il surnatante attraverso un colino cellulare da 100 micrometri per ottenere una soluzione di estrazione limpida e priva di particelle.
Caricare il surnatante filtrato sul gradiente di saccarosio pre-preparato e attendere che raggiunga l'equilibrio. Quindi, ultracentrifugare il gradiente utilizzando un rotore a secchiello oscillante a 210.000 G per 3,5 ore a quattro gradi Celsius con i massimi tassi di accelerazione e decelerazione. L'RNA non polisomiale e polisomiale vengono separati in base alla loro densità nella corrispondente soluzione di gradiente di saccarosio.
Preparare la soluzione chase per la pompa a siringa per microvolumi composta da 70% saccarosio, 10% glicerolo e 0,02% blu di bromofenolo. Mescolare accuratamente la soluzione per 30-40 minuti. Dopo aver iniettato la soluzione di inseguimento nel gradiente, utilizzando il software, controllare il frazionatore del gradiente di densità.
Quindi calibrare la macchina con acqua deionizzata. Dopo l'ultracentrifugazione, posizionare la provetta sul frazionatore a gradiente di densità. Utilizzando il sistema di perforazione del tubo, collegare il tubo alla pompa a siringa e al rilevatore di raggi ultravioletti.
Commuta il frazionatore del gradiente di densità in modalità di controllo software remoto. Impostare la portata di iniezione della pompa a siringa per microvolumi su tre millilitri al minuto. Avviare il processo per ottenere il grafico del profilo dei polisomi misurando la densità ottica a 254 nanometri utilizzando il frazionatore.
Sulla base delle misurazioni del profilo dei polisomi, raccogliere separatamente le frazioni di RNA non polisomiale e polisomiale. Mescolare accuratamente le frazioni di RNA raccolte con una soluzione pre-fredda due volte ad alto contenuto di sale. Quindi aggiungere otto microlitri di uno stock diluito di poli-A RNA eucariotico di controllo dal kit.
Centrifugare l'RNA miscelato in soluzione ad alto contenuto di sale con un rotore a secchiello oscillante a 450.000 G per cinque ore a quattro gradi Celsius. Versare accuratamente il surnatante e lavare il pellet di RNA tre volte con 500 microlitri di acqua pre-fredda trattata con DEPC. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 500 microlitri di reagente di estrazione dell'RNA al campione di RNA.
Mescolare e incubare per 10 minuti. Aggiungere 100 microlitri di cloroformio e mescolare accuratamente. Incubare per 10 minuti per consentire la separazione di fase.
Centrifugare la miscela a 12.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire lo strato acquoso chiaro superiore contenente RNA in una nuova provetta e mescolarlo delicatamente con un volume uguale di isopropanolo. Incubare la miscela a meno 20 gradi Celsius per due ore per far precipitare l'RNA.
Dopo la precipitazione, centrifugare nuovamente e scartare il surnatante, lasciando il pellet di RNA sul fondo. Lavare il pellet di RNA con un millilitro di etanolo pre-freddo al 75%. Centrifugare a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e asciugare all'aria il pellet di RNA.
Dopo l'essiccazione, risospendere il pellet in 30 microlitri di acqua trattata con DEPC. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a spettro completo da 220 a 750 nanometri, concentrandosi sulla densità ottica a 260. Il profilo dei polisomi ha mostrato una netta separazione tra le frazioni non polisomiali e polisomiali in condizioni normali.
Lo stress termico a 40 gradi Celsius ha ridotto significativamente l'intensità del segnale della frazione polisomiale e questo effetto è stato invertito dopo un recupero di due ore a 22 gradi Celsius, riportando il segnale ai livelli di controllo. I risultati dell'estrazione dell'RNA hanno indicato che lo stress da calore ha ridotto la percentuale di RNA nella frazione polisomiale, che è stata ripristinata dopo il recupero a 22 gradi Celsius.
