We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes.">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li><li>Tscherne, J. 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B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response.">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li><li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li><li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis.">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li><li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly(A)++mRNA+in+actively+translating+polyribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li><li>Riley, A., Jordan, L. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Profilatura polisomale è una tecnica potente che consente la quantificazione dello stato della traduzione di trascritti specifici in diverse condizioni di trattamento. Si tratta di una tecnica molto semplice principio che tuttavia richiede diverse fasi di esecuzione, alcune delle quali sono critici per la produzione di buoni profili polisoma. Questi passaggi chiave sono: 1) uso di prodotti chimici RNase-free e plasticware, 2) la preparazione di ottimi gradienti di saccarosio (nella nostra esperienza un 10-50% gradienti di saccarosio funzionano meglio per risolvere in modo efficiente 40 / 60S subunità e mRNA con ribosomi legato), e 3 ) utilizzando cellule che sono in crescita esponenziale e non confluenti oltre l&#39;80%, al fine di catturare i più alti tassi di traduzione. Quest&#39;ultimo passo dovrebbe essere presa in considerazione quando si fa trattamenti lunghi cellulari, come knockdown gene o sovraespressione, in modo che la quantità di cellule per piastra sarà una funzione di quanto le cellule saranno confluenti al punto finale. Nei risultati presented qui, polisoma analisi del profilo è stato uno strumento importante per valutare il ruolo PDCD4 nella regolazione traduzione dei IRES-mRNA ospitano XIAP e Bcl-xL 12. Il fatto che non abbiamo osservato alcun cambiamento nei profili generali polisoma su PDCD4 knock-down (Figura 1B) ci ha permesso di concludere che PDCD4 non ha compromesso traduzione globale cellulare nelle condizioni dell&#39;esperimento. Abbiamo poi utilizzato l&#39;analisi di RT-qPCR per determinare la distribuzione del XIAP e Bcl-xL mRNA in cellule trattate con PDCD4 o siRNA di controllo. qPCR è un metodo di scelta per analizzare profili polisoma, rispetto allo standard di RT-PCR o Northern blotting, perché permette di quantitativa piuttosto che un&#39;analisi semi-quantitativa della distribuzione mRNA e per la rilevazione di sottili variazioni nell&#39;efficienza traslazionale tra i trattamenti. Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di dimostrare che la distribuzione delle XIAP e Bcl-xL mRNA (espresso come percentuale del target totale mRNA in tutto il gradient) era significativamente spostato in poliribosomi pesanti (mRNA con un gran numero di ribosomi ad essi associati) dopo PDCD4 knock-down (Figura 1D, E), indicando così un aumento di definizione di questi mRNA. Ciò è stato ulteriormente confermato da un aumento XIAP e Bcl-xL livelli di proteina, ma non nei loro livelli di RNA allo stato stazionario (Figura 1F, G). È importante sottolineare che la distribuzione polisoma della variante non-IRES di XIAP è rimasta invariata tra le cellule trattate e non trattate (Figura 1C). In alternativa, l&#39;efficienza traduzionale potrebbe essere presentato come un rapporto di contenuto di mRNA in polisomi (solitamente frazioni 5 a 10) rispetto monosomes (solitamente frazioni 2 a 4) 14. L&#39;uso dei controlli in tutta il protocollo è importante nel convalidare qualsiasi polisoma risultato profiling, come picchi osservati dalle letture di assorbanza a 254 nm non possono da soli essere attribuito ad RNA ribosomiale (detergentes, come Triton X-100 fortemente assorbono in questa regione dello spettro e possono oscurare 40 / 60S picchi nella parte superiore del gradiente). Sfumature in bianco, senza lisato e / o con tampone lisato devono essere eseguiti per determinare il contributo relativo dei buffer per l&#39;assorbanza a 254 nm. Artefatti strutture di ordine superiore possono anche portare a interpretazioni errate di polisomi dove ci sono in effetti nessuno (ad esempio, &quot;pseudo-polisomi&quot; 20). Sequestranti magnesio (utilizzato durante tutta la procedura di stabilizzare ribosomi 80S) con l&#39;EDTA cationi bivalenti chelante aggiunti lisati e al buffer gradiente (20 mM per 15 min) provoca la separazione del ribosoma nei suoi componenti piccoli (40S) e grandi (60S ) subunità. Pertanto, se i picchi di assorbanza a 260 nm registrati sono infatti polisomi, trattamento EDTA collasserà il profilo tale osserverà una singola massima nella parte superiore del gradiente che corrisponde a liberare mRNA e unità ribosomiale (dati non mostrati). Coincidentecon EDTA indotta crollo del profilo, tutti gli obiettivi specifici analizzati da qPCR occorre ora trovato nella parte superiore del gradiente. Il numero dei ribosomi associati ad un mRNA non è sempre un indicatore di quanto efficientemente quel particolare mRNA viene tradotto. Infatti, ci sono contesti specifici in cui traduzione attiva su polisomi diventa stallo 21,22 che il lettore dovrebbe essere a conoscenza. Determinare se trascrizioni sono attivamente impegnati con i macchinari di traduzione può essere fatto da a) trattando il campione con puromicina, che a differenza di EDTA, provoca &#39;run-off&#39; di ribosomi che sono attivamente translocating in un mRNA, oppure b) il trattamento del campione con homoharringtonine che inibisce la traslocazione di solo il primo ribosoma al codone di inizio, di nuovo causando &#39;run-off&#39; di tutti i ribosomi translocating a valle. L&#39;uso di trascritti di controllo per l&#39;analisi qPCR è anche critico. Il Seleczione di trascrizioni che non sono affetti da diverse condizioni di trattamento come alcuni geni housekeeping (GAPDH, actina, tubulina Nucleolina), mRNA ribosomali (18S, RPL13A) o in questo caso la variante non-IRES del XIAP IRES, è importante in verificare se l&#39;effetto del trattamento sulla traduzione è specifica o generalizzata. Queste trascrizioni di controllo possono essere utilizzati per normalizzare la distribuzione dei mRNA analizzati come è stato fatto qui (XIAP e Bcl-xL mRNA sono stati normalizzati per GAPDH mRNA e espressa in percentuale del contenuto totale di mRNA rappresentato dalla somma del contenuto di mRNA in ogni frazione ) o, in alternativa, di destinazione e di controllo mRNA possono essere espressi come valori assoluti ed esposti separatamente. analisi qPCR dei lisati ingresso (solitamente il 10% del volume totale) è un altro passo che il controllo della distribuzione di specifici mRNA. Idealmente, il contenuto di un trascritto di mRNA specifico nel lisato ingresso dovrebbe essere paragonabile alla somma del contenuto di mRNA in tutte le 10 frazioni analizzati. Infine, Un passaggio facoltativo per il controllo per il fenolo: cloroformio fase di estrazione è a picco ogni frazione polisoma con un in vitro trascritto mRNA giornalista (come CAT, cloramfenicolo acetil transferasi) che verrà successivamente quantificato qPCR e può anche essere usato per normalizzare la dati 14. Come con qualsiasi tecnica, la profilatura polisoma presenta alcune limitazioni. Il fatto che di solito un minimo di 10 frazioni (cambiamenti più sottili di efficienza di traduzione può richiedere 20 o più) devono essere raccolti in modo da avere distribuzioni polisoma curato rende questo passaggio limitante, nel senso che solo un massimo di 4 campioni può essere analizzati alla volta per poter gestire comodamente estrazione dell&#39;RNA e analisi qPCR di 40 campioni e controlli di ingresso 4 alla volta. La dimensione del campione può facilmente aggiungere il passo con il numero di trascrizioni devono essere analizzati e il numero di qPCR replica di fare, e questo può essere costoso. Un altro limite di una base-qPCR polisomale profiling unnalisi è che può essere fatto solo su un approccio basato candidato (dove i trascritti da analizzare sono noti in anticipo) e non possono essere applicati per l&#39;analisi dell&#39;intero genoma di traduzione. Tuttavia, all&#39;inizio del 21 ° secolo, gli investigatori hanno cominciato a interrogare i loro RNA polisomale a livello genomico mediante DNA microarrays 15 e più recentemente con sequenziamento di prossima generazione 16,17. In questo approccio potente, profilazione polisomale viene eseguita come descritto in questo protocollo la differenza che, invece di effettuare analisi qPCR delle singole frazioni, monosomes frazioni (frazioni di solito 2-4) e polisomi frazioni (di solito frazioni) sono raggruppati insieme e variazioni nella traduzione globale analizzati da DNA microarray o dell&#39;intero genoma RNA sequencing. Quindi con questo approccio, è possibile valutare tutti gli mRNA la cui distribuzione si sposta dal polisomi a monosomes (diminuzione in traduzione) o viceversa (aumento in traduzione) su un trattamento specificomento. Validazione e quantificazione di specifica distribuzione polisomi di mRNA possono quindi essere fatto da qPCR. Un uso ancora più potente del principio polisomale profiling è profiling ribosoma. Ulteriore estensione alto rendimento di questa tecnica è stato segnalato di recente che consente il monitoraggio simultaneo di centinaia di polisoma 23 frazioni. Ciò fornisce un chiaro vantaggio quando sondare l&#39;efficienza traslazionali delle collezioni mutanti o in una grande scala schermi RNAi. Profiling ribosoma è una tecnica che si avvale di sequenziamento di nuova generazione per mappare frammenti di RNA protetti da ribosomi (impronte ribosoma) impegnati nella sintesi proteica 24,25. In questa tecnica, traslocazione ribosoma può essere inibita con cicloeximide (reversibile) o emetine (irreversibile) seguita da lisi cellulare e la digestione RNasi per produrre una popolazione di impronte ribosoma. I ribosomi sono arricchiti, l&#39;RNA totale è isolato, e contaminando ribosomiale e RNA ribosomiale mitocondriale viene rimosso.Impronte di RNA di circa 26-28 nucleotidi sono isolati, a trascrizione inversa, trasformato in una libreria di cDNA e sequenziati 26. A differenza di profilazione polisoma di serie, questo approccio non solo identifica specifici mRNA che sono regolati traslazione, ma produce anche informazioni mRNA specifico per una risoluzione di codone, come l&#39;occupazione e la densità esatta di ribosomi lungo una trascrizione specifico. Ciò è particolarmente interessante per mRNA con specifiche modalità di traduzione, come mRNA IRES-ospitano, in quanto potrebbe dare più informazioni su dove sulla trascrizione ribosoma-reclutamento si sta verificando.

Regolazione della sintesi proteica (traduzione) è un processo cellulare fondamentale che è intimamente legata alla sopravvivenza cellulare. Dato che la traduzione consuma più del 50% dell&#39;energia della cellula, non è sorprendente che la traduzione è strettamente regolata e che perturbazioni in una versione non sono ben tollerati. Al contrario, molti processi cellulari aberranti richiedere che le macchine di traduzione e l&#39;uscita di traduzione (cioè proteoma) devono essere modificati. Questo è spesso il caso in vari stati di risposta allo stress e malattie, ed è probabilmente meglio esemplificato nel cancro. Uno dei principali vantaggi del controllo traduzionale è la capacità delle cellule di riprogrammare rapidamente la produzione di proteine ​​in risposta a vari trigger esterni ed interni, così bene meccanismo di regolazione che consigli l&#39;equilibrio tra la sopravvivenza delle cellule e la morte 1. Due aspetti del controllo traduzionale sono particolarmente interessanti; comprensione della natura del mec normativohanism (s) ed elementi di comando che consentono una versione specifica, e l&#39;identificazione di specifici mRNA e dei loro prodotti proteici che partecipano alla risposta cellulare al particolare trigger che ha suscitato una versione selettiva in primo luogo. Profilatura polisoma è una tecnica che permette efficace studio di entrambi i processi. L&#39;obiettivo generale della tecnica polisoma profiling è quello di studiare e quantificare lo stato di traduzione di specifici mRNA in condizioni cellulari diversi. Il principio della tecnica è quello di catturare la traduzione dell&#39;mRNA da &#39;&#39; congelamento &#39;&#39; ribosomi traducono attivamente su diversi trascritti e separare i poliribosomi risultanti da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio, consentendo una distinzione tra trascrizioni altamente tradotte (vincolato da più ribosomi) e quindi mal quelli tradotti (vincolati da uno o due ribosomi). In questo particolare protocollo, la cicloesimmide antibiotico che si lega allaSubunità ribosomiale 60S e inibisce la produzione di deacetilato tRNA dal sito E ribosoma 2, viene utilizzato per inibire la traslocazione del ribosoma ribosomi e stallo sul mRNA traduzione. Tuttavia, altri agenti bloccanti come emetine tale definizione anche i blocchi di allungamento 3, può essere utilizzato. A differenza del western blotting e 35 S-metionina tecniche di marcatura che misurano l&#39;output finale del processo di traduzione, polisoma profilazione ha il vantaggio di misurare ribosomi associazione con mRNA attivamente tradotte, consentendo così uno studio più dettagliato di meccanismi di conversione in condizioni diverse. Quindi, la tecnica può essere facilmente adattato per studiare specificamente diverse modalità di definizione 4-6, fattori proteine ​​coinvolte nella regolazione definizione 7-9, condizioni di stress che interessano la sintesi proteica 1,10,11 o gli effetti delle strutture di mRNA come IRES oa monte aperte fasi di lettura su proteine ​​synthESIS 12-14. Al giorno d&#39;oggi, polisoma applicazioni di profilatura sono ancora più ampia con l&#39;uso di DNA microarray 15 o sequenziamento di prossima generazione 16,17 per analizzare polisomi-associati mRNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gradient Master 108 automated gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">BIOCOMP</td>
			<td style="width:119px;">107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">LABCONCO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4517000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Beckman Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Model # L-100-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Density gradient fractionator</td>
			<td style="width:135px;">TELEDYNE ISCO</td>
			<td style="width:119px;">69-3873-246</td>
			<td>Composed of: tube piercing system,&#160; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">WinDaq data acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">DATAQ INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">WINDAQ/LITE</td>
			<td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14x89 mm)</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td>
			<td style="width:135px;">DiaMed</td>
			<td style="width:119px;">PRE1900-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td>
			<td style="width:135px;">SafeSeal</td>
			<td style="width:119px;">12000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sucrose (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">573113</td>
			<td>MW = 342.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:135px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium chloride (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">7710</td>
			<td>MW = 58.44 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5980</td>
			<td>MW = 203.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris Base (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-01</td>
			<td>MW = 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9400</td>
			<td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">RNaseZap Rnase inactivation solution</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9722</td>
			<td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

Regolazione della sintesi proteica rappresenta un punto di controllo chiave nella risposta cellulare allo stress. In particolare, RNA discreto elementi regolatori sono stati mostrati per permettere alla traduzione selettiva di specifici mRNA che codificano per proteine ​​tipicamente richiesti per una particolare risposta allo stress. L&#39;identificazione di questi mRNA, così come la caratterizzazione dei meccanismi di regolamentazione responsabili della traduzione selettiva è stata in prima linea di biologia molecolare per qualche tempo. Profiling polisoma è un metodo pietra miliare in questi studi. L&#39;obiettivo di polisoma profiling è quello di catturare la traduzione dell&#39;mRNA immobilizzando ribosomi traducono attivamente diverse trascrizioni e separare i poliribosomi risultanti da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio, consentendo così una distinzione tra trascrizioni altamente tradotti e quelli mal tradotti. Questi possono poi essere ulteriormente caratterizzate da metodi tradizionali biochimica e biologia molecolare. È importante sottolineare che, combinando polysome profilatura con approcci genomici ad alto rendimento consente una vasta analisi di scala di regolazione traduzionale.

Abbiamo recentemente descritto un nuovo ruolo per il tumore soppressore PDCD4 come un inibitore selettivo di traduzione degli mRNA codificanti inibitori di apoptosi XIAP e Bcl-xL 12 IRES-ospitare. Profiling polisoma era una tecnica fondamentale per dimostrare il coinvolgimento specifico di PDCD4 nella traduzione IRES-mediata. HEK293 cellule sono state trasfettate per esaurire i livelli endogeni di PDCD4 (Figura 1A) e poi sottoposti ad polisoma analisi del profilo. Abbiamo osservato che la riduzione dei livelli di PDCD4 non ha compromesso la traduzione globale cellulare, come giudicato dalla mancanza di cambiamenti nel profilo polisoma quando si confrontano i siCTRL e siPDCD4 cellule trattate (Figura 1B). Allo stesso modo, polisoma distribuzione di non-IRES variante di XIAP 19 è rimasta invariata tra le cellule trattate e non trattate (Figura 1C). Al contrario, polisoma distribuzione dei mRNA due IRES-ospitano, XIAP e Bcl-xL, è risultata significativamente modificata. In assenza di PDCD4 la distribuzione di questi due mRNA viene spostata in ribopolysomes pesanti (Figura 1D, E). Dal momento che questo non è accompagnato da variazioni dei livelli di steady-state di XIAP e Bcl-xL mRNA (Figura 1F) Questi risultati dimostrano una maggiore traduzione di XIAP e Bcl-xL in cellule con livelli PDCD4 ridotti, che è stato ulteriormente confermato mediante Western blotting (Figura 1G). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Profiling polisoma identifica PDCD4 come inibitore selettivo della traduzione XIAP e Bcl-xL (A) HEK293 cellule sono state trattate con PDCD4 siRNA o di controllo (CTRL), non-targeting siRNA, lisati e sottoposti ad analisi Western blot con anti-PDCD4 e gli anticorpi anti-nucleolina per verificare il grado di PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 è stato abbattuto come in (A) eI lisati cellulari sono stati sottoposti a polisoma profilatura. Profilo polisoma Rappresentante è mostrato nel pannello superiore; distribuzione del XIAP non IRES (C), Bcl-xL (D), e XIAP IRES (E) mRNA relativi a quella della GAPDH è mostrato come la percentuale di mRNA totale (% mRNA) di ogni frazione. (F) fissa livelli di mRNA -state sono stati misurati mediante RT-qPCR in PDCD4 siRNA o di controllo (CTRL) siRNA cellule trattate. (G) I lisati da (A) sono stati anche sottoposti ad analisi Western Blot con anticorpi anti-XIAP, anti-Bcl-xL, e anticorpi anti-nucleolina. (NB. I dati presentati nella figura 1 sono stati originariamente pubblicati in 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.9K Views.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

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Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Ricerca

Biologia

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Un metodo facile per piante polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sondare la cinetica dell'mRNA nello spazio e nel tempo in Escherichia coli utilizzando la fluorescenza a singola molecola a due colori in ibridazione situ

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...