Per iniziare, metti una provetta da 50 millilitri sul ghiaccio e aggiungi una soluzione di collagene insieme ad altri componenti in sequenza. Agitare il tubo per mescolare accuratamente. Utilizzando una pipetta P10, aggiungere una soluzione molare di idrossido di sodio goccia a goccia, agitando la soluzione di miscelazione per regolare il pH a 7,3.
Aggiungere 1,25 millilitri di matrice della membrana basale alla miscela di cinque millilitri di collagene e mescolare delicatamente la soluzione. Quindi, posizionare una piastra a 12 pozzetti sul ghiaccio per due minuti. Utilizzando punte a foro largo, aggiungere lentamente la miscela di matrice di collagene e membrana basale alla piastra a 12 pozzetti.
Posizionare la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore a 37 gradi Celsius per due ore per solidificare il primo strato di idrogel. Conservare il collagene rimanente una miscela di matrice della membrana basale sul ghiaccio per un uso successivo. Quindi trasferire circa 60 aggregati di cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
E raffreddare il tubo con ghiaccio per cinque minuti. Utilizzando un puntale per pipetta P200, rimuovere con cautela il fluido dalla provetta. Aggiungere 1,5 millilitri di collagene una miscela di membrana basale, goccia a goccia, sugli aggregati cellulari e mescolarli delicatamente utilizzando una punta di pipetta P200 a foro largo per ririspendere.
Trasferire la piastra con il primo strato di idrogel dall'incubatore alla cabina di biosicurezza. Aggiungere 1,5 millilitri di sospensione aggregata sullo strato di idrogel polimerizzato e agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente gli aggregati. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due ore.
Preriscaldare il mezzo di differenziazione vascolare due in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Aggiungere due millilitri di terreno a ciascun pozzetto e coltivare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Cambiare il terreno ogni tre giorni con un terreno di differenziazione vascolare fresco preriscaldato due.
Gli organoidi esprimevano CD31, ERG1 e PDGFR beta, indicando la presenza di cellule endoteliali vascolari e parassiti. Le reti vascolari sono state visualizzate tramite microscopia a immunofluorescenza a montatura intera dopo la pulizia dei tessuti. Gli organoidi maturi colorati il giorno 17 hanno mostrato reti vascolari che incapsulano gli sferoidi all'interno del blocco di gel.
Gli organoidi recuperati il giorno 28 avevano reti vascolari che avvolgevano gli sferoidi invece di espandersi radialmente.
