Questo metodo può essere eseguito in qualsiasi laboratorio attrezzato per esperimenti di coltura cellulare. Usando questo metodo, possiamo approfondire la nostra comprensione dello sviluppo renale e dei percorsi della malattia. Questo è un metodo relativamente semplice e poco costoso rispetto ad altri per generare organoidi renali.
La più grande sfida di questa tecnica è mantenere una coltura di cellule staminali pluripotenti umane di alta qualità. È fondamentale che le cellule siano mantenute a meno dell'80% di confluenza e divise regolarmente. I ricercatori nuovi alla coltura umana di cellule staminali pluripotenti dovrebbero familiarizzare con le linee di cellule staminali prima di procedere alla differenziazione.
Iniziare il test organoide renale aggiungendo due millilitri di mezzo E5-ILP completo in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa a sei pozzetti. Coltiva cellule staminali pluripotenti umane, o hPSC, in piastre trattate con colture tissutali da 100 millimetri fino a raggiungere il 60% di confluenza. Lavare le hPSC due volte con circa otto millilitri di DPBS.
Aspirare il DPBS, quindi aggiungere due millilitri di Dispase dropwise per coprire le cellule e incubarle per sei minuti a 37 gradi Celsius. Lavare le cellule tre volte con circa 10 millilitri di DPBS. Aspirare il DPBS, quindi inclinare la piastra di 45 gradi e raschiare le celle verso il basso con un sollevatore di celle.
Lavare le colonie dall'alto con sei millilitri di mezzo E5-ILP completo usando una pipetta sierologica da 10 millilitri. Quindi, tenendo la pipetta verticalmente, rompere grandi colonie pipettando delicatamente su e giù, facendo attenzione a non toccare i lati della piastra di coltura. Distribuire uniformemente i grappoli di colonie aggiungendo un millilitro per pozzetto nella piastra a sei pozzetti, quindi posizionare la piastra su uno shaker orbitale all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius.
In alternativa, se non è disponibile uno shaker orbitale, le cellule possono essere coltivate staticamente. Il secondo giorno, dopo aver lasciato che i corpi embrioidi si depositassero nella parte inferiore della piastra, inclinare la piastra di 45 gradi e aspirare lentamente il mezzo dall'alto, lasciando un millilitro per pozzetto. Aggiungere due millilitri di mezzo completo preparato per pozzetto e riportare la piastra allo shaker.
Il terzo giorno, dopo aver aspirato il mezzo come precedentemente dimostrato, raccogliere tutti i corpi embrioidi con attenzione da ciascun pozzetto usando una pipetta sierologica da 10 millilitri e trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri. Per raccogliere eventuali corpi embrioidi rimanenti, sciacquare ciascuno con un millilitro di DMEM a basso contenuto di glucosio e aggiungerli allo stesso tubo conico da 50 millilitri. Mentre aspetti che i corpi embrioidi si depositino sul fondo del tubo, aggiungi due millilitri di mezzo allo stadio II a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti.
Successivamente, setacciare grandi corpi embrioidi posizionando un filtro cellulare da 200 micrometri sopra un nuovo tubo conico da 50 millilitri e pipettando attentamente tutti i corpi embrioidi sopra il colino cellulare. Risciacquare il colino cellulare con altri cinque millilitri di DMEM per raccogliere eventuali corpi embrioidi bloccati nel colino. Nelle fasi successive, utilizzare prima un filtro da 500 micrometri per setacciare corpi embrioidi molto grandi, quindi far passare il filtrato attraverso un filtro da 200 micrometri per setacciare corpi embrioidi molto piccoli senza tubuli.
Raccogliere i corpi embrioidi di dimensioni corrette, tra 200 e 500 micrometri, invertendo il filtro da 200 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri e lavando il filtro con DPBS. Dopo lo sforzo, lasciare che i corpi embrioidi si depositino sul fondo del tubo conico, quindi aspirare il surnatante e lavare con circa 10 millilitri di DMEM. Quindi, risospendere i corpi embrioidi in sei millilitri di stadio II del mezzo.
Trasferire i corpi embrioidi nella piastra di attacco ultra-bassa a sei pozzetti, distribuendoli uniformemente tra i pozzetti. Poiché la maggior parte degli organoidi si raccoglie nella parte superiore della pipetta, lasciare circa mezzo millilitro alla fine, quindi toccare delicatamente la punta al mezzo in ciascun pozzetto, consentendo agli organoidi di fluire nel pozzo. Trasferire i corpi embrioidi in un pallone da 125 millilitri con 45 millilitri di mezzo stage II.
Impostare la velocità di agitazione magnetica a 120 giri / min e posizionare il pallone nell'incubatrice. Per nutrire i corpi embrioidi o gli organoidi renali, lasciarli depositare brevemente sul fondo del pallone spinner, quindi sollevare il coperchio da un braccio laterale del pallone e posizionare la pipetta aspirante all'interno con la punta che tocca la parete interna opposta. Inclinare lentamente la pipetta verso il basso e aspirare circa la metà del mezzo.
Ricostituire con 20 millilitri di mezzo fresco Stage II pipettandolo attraverso la stessa apertura. Utilizzare lunghe pinze sterili per posizionare con cura una barra magnetica in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con corpi embrioidi o organoidi renali. Posizionare la piastra sulla piastra magnetica a sei ruote e impostare la velocità su 120 giri / min.
Affinché le barre magnetiche si aggancino in posizione e inizino a girare, impostare prima il livello di potenza su 100. Una volta che tutte le barre iniziano a girare, porta il livello di potenza a 25. Mantenere gli organoidi renali cambiando metà del mezzo come precedentemente dimostrato.
L'immunofluorescenza delle sezioni di paraffina degli organoidi renali del giorno 14 mostra la presenza di segmenti di nefrone come i tubuli renali che esprimono il fattore nucleare epatocitario-1 beta e la lectina del tetragonolobus del loto, nonché cluster di podociti che esprimono il fibrosarcoma muscolo-oponeurotico V-maf oncogene omologo B e nefrina. Le modifiche in questo protocollo possono supportare l'espansione delle cellule endoteliali, come confermato dalla colorazione con molecola di adesione piastrinica ed endoteliale-1 al giorno 26 della coltura. Le cellule staminali pluripotenti umane devono essere trattate con Dispase per il periodo di tempo appropriato, quindi accuratamente lavate per rimuovere tutte le tracce.
Se Dispase non viene completamente rimosso, può portare alla morte cellulare e al raggruppamento di corpi embrioidi. Questo metodo ci ha aiutato a esaminare lo sviluppo di malattie renali congenite, nonché vari percorsi di danno renale e il potenziale per interventi terapeutici in vitro.
