Gli studi sono stati finanziati dal Wellcome Trust e meningite nel Regno Unito. HBMEC linea cellulare è stata fornita dal dottor KS Kim. L&#39;imaging confocale e microscopia elettronica sono stati eseguiti nel Fondo per Bioimmagini Wolfson, Università di Bristol. Vorremmo anche ringraziare l&#39;onorevole Alan Leard, Dr. Mark Jepson (Università di Bristol), e il signor Alan Tilley (PerkinElmer) per il loro aiuto e consigli.

1. Immunofluorescenza protocollo Semina, infezione e immuno-colorazione Le seguenti procedure richiedono idoneo livello di cultura della sicurezza dei tessuti e le strutture di laboratorio microbiologico. GIORNO 1 A. Preparazione delle cellule bersaglio per l&#39;infezione <ol><li> HBMECs seme al 50% confluenza (~ 1.5x10 4 celle / cm 2) sul vetro coprioggetto (16 mm di diametro) inserito in un 12-pozzetti (3,8 cm 2 area di crescita / pozzetto). Terreno di crescita: RPMI 1640 integrato con il 15% di siero (56 ° C, 30 min) FBS, 2 mM glutamina, 1 mM sodio piruvato, 100 U / mL di penicillina / streptomicina, 1% (v / v) MEM aminoacidi non essenziali acidi soluzione e l&#39;1% MEM soluzione di vitamine. </li><li> Cultura per tutta la notte (O / N) a 37 ° C, in un 5% di CO 2 incubatore. </li></ol> B. coltura batterica <ol><li> Crescere il ceppo di interesse di O / N (16-18 h) sul richiesto Infusion ad esempio Cuore medio Cervello (BHI) piastre di agar integrato con il 10% sangue di cavallo riscaldata a 37 ° C in 5% CO 2 nell&#39;atmosfera 4. </li></ol> 2 ° GIORNO Preparazione A. Di batterica (N. meningitidis) Sospensione <ol><li> Utilizzando un loop 10 microlitri cultura, fare una sospensione della cultura durante la notte batterica in 2 ml generiche su baja california (PBS con calcio e magnesio). </li><li> Consentire grossi aggregati batterici per risolvere lasciando la sospensione per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). </li><li> Senza disturbare il pellet, trasferire l&#39;1 ml della sospensione (stock inoculo) in una provetta sterile. </li><li> Per stimare i numeri batterica dell&#39;inoculo magazzino, aggiungere aliquote (20-50 mL) di provette contenenti volumi di 1 ml di 1% SDS a 0,1 M NaOH e mescolare delicatamente per solubilizzare. </li><li> Misurare il contenuto di acido nucleico della soluzione determinando l&#39;assorbanza a 260 nm (A260). Nelle nostre mani, A260 di 1 corrisponde a 5x10 8 unità formanti colonie / ml (ufc / ml). Questo può essere verificato preparando una serie di diluizioni del inoculo stock in generiche su baja california, placcatura su piastre di agar e il conteggio colonie dopo O / N incubazione. </li><li> Diluire una parte dell&#39;inoculo magazzino nel medio infezione [(M199 integrata con il 2% decomplemented (56 ° C, 30 min) nel siero umano normale (SSN)] per ottenere la densità richiesta per l&#39;infezione batterica delle cellule bersaglio. <ol><li> Nel nostro laboratorio, un rapporto di infezione di 200-300 batteri per cella di destinazione viene utilizzato di routine. </li></ol></li></ol> B. infezione delle cellule Cultura <ol><li> Lavare i coprioggetti in coltura con cellule bersaglio tre volte con mezzo di Hank per rimuovere ogni traccia di antibiotici. </li><li> Infettare le cellule preparati al momento con sospensioni batteriche (descritto sopra) per 3 ore a 8 ore a 37 ° C, nel 5% di CO 2. </li><li> Al termine del periodo di infezione, le cellule lavare tre volte con PBS e fissare in 500 ml di 2% paraformaldeide (PFA) per 30-45 minuti a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. <ol><li> Fissazione paraformaldeide alla concentrazione e il tempo sopra indicato è stato ritenuto idoneo per la conservazione della morfologia batterica e cellulare. </li></ol></li><li> Dopo il lavaggio off paraformaldeide, permeabilise la paraformaldeide-cellule fissate incubando a 0,1% Triton X-100 diluito in PBS per 10 min. </li><li> Lavare i campioni 3 volte con PBS. </li><li> Procedere alla colorazione immuno-o, in alternativa, lasciare i campioni in 500 ml di 1% BSA / PBST O / N a 4 ° C. </li></ol> 3 ° GIORNO Immuno-colorazione Colorazione dei batteri intracellulari e α-actinina possono essere eseguite in sequenza o simultaneamente con l&#39;uso di appropriati anticorpi primari e secondari come segue: tutte le procedure possono essere eseguite in 12-pozzetti. <ol><li> Blocca i coprioggetti contenente le cellule permeabilised con 500 ml di 3% BSA / PBST (PBS contenente 0,05% Triton X-100) per 30-60 min a RT </li><li> Dopo il lavaggio con PBS, il trasferimento di ogni coprioggetto di un nuovo pozzo secco in 12-pozzetti. </li><li> Aggiungere gli anticorpi primari contro i batteri e α-actinina; ottanta a 100 l di anticorpi per coprioggetto è sufficiente aggiunto attentamente per coprire la superficie del vetrino. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. <ol><li> Abbiamo usato antisiero policlonale di coniglio contro la Neisseria meningitidis (laboratorio-raise) e anticorpi murini monoclonali (mAb) contro α-actinina (Abcam) contemporaneamente. In alcuni esperimenti, al posto di anti α-actinina, anticorpi monoclonali contro l&#39;actina e vimentina sono stati utilizzati (Sigma). </li></ol></li><li> Al termine della incubazione, aggiungere 200 ml di PBS al pozzo, sollevare il coprioggetti e posto in un nuovo pozzo contenente 500 microlitri di PBS. </li><li> Dopo 5 minuti, togliere PBS pipettando e quindi aggiungere PBS fresco. Ripetere due volte. Trasferimento ad un coprioggettinuovo pozzo asciutto. </li><li> Aggiungere gli anticorpi adeguati secondari coniugati con fluorocromi diversi diluito in 1% BSA / PBST; incubare a temperatura ambiente per 1 ora al buio. <ol><li> Per il rilevamento di batteri, abbiamo usato anti-coniglio coniugato con TRITC Ig e per α-actinina e altri rilevazione delle proteine ​​del citoscheletro, abbiamo usato Ig anti-topo coniugato con FITC o-(Sigma) o Alexa Fluor 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> Al termine della incubazione, lavare come nei passaggi 4 e 5. </li><li> Contatore macchia con 0,6 mg / ml DAPI in PBS (DNA macchia) per 5 min a RT al buio. </li><li> Risciacquare con PBS. </li><li> Monte coprioggetti (cellule rivolto verso il basso) su vetrini con una goccia di mezzo di montaggio (e, g. Mowiol o Vectashield) </li><li> Conservare al buio a 4 ° C. </li><li> I campioni sono pronti per l&#39;osservazione al microscopio. </li></ol> 2. Microscopia confocale a scansione laser (CLSM) Di osservare e catturare le immagini di batteri intracellulari e degli elementi del citoscheletro, abbiamo utilizzato campioni immunolabelled e immagini catturate con una SP5-AOBS Leica microscopio confocale a scansione laser collegato a un Leica DM i6000 microscopio invertito epifluorescenza. Tutte le immagini sono stati raccolti utilizzando un NA 63x 1,4 obiettivo ad immersione olio e di processo con il software Leica. CLSM procedura: <ol><li> Per iniziare la procedura di CLSM, aggiungere una goccia di olio di immersione per l&#39;obiettivo e mettere il vetrino, coprioggetto rivolto verso il basso, sul palco microscopio. </li><li> Impostare il microscopio ad un modo visuale e trovare l&#39;area di interesse utilizzando i pezzi occhio del microscopio. </li><li> Utilizzo del software Leica, selezionare la modalità di acquisizione xyz. </li><li> Selezionare il formato 512 x 512 (dimensioni del fotogramma). Per gli studi colocalisation, la risoluzione più alta, la più accurata dell&#39;immagine, tenendo presente il limite di risoluzione del microscopio. Quindi selezionare la modalità bidirezionale X, che aumenterà la velocità di scansione e contribuire a ridurre fotometabolismo. </li><li> Configurare le impostazioni di scansione sequenziale. Fare clic sulla funzione &quot;seq&quot; e scegliere una delle modalità di scansione. Usiamo &quot;tra le righe&quot; modalità. </li><li> Fasci laser selezionare in base al fluorocromi coniugati agli anticorpi secondari: 405 nm per DAPI (blu), 488 nm per Alexa Fluor 488 (verde) e 561 nm per TRITC (rosso). Attivare tubo fotomoltiplicatore (PMT) 1, 2 e 3, rispettivamente. Regolare le impostazioni PMT di rilevare la lunghezza d&#39;onda corretta emissione. </li><li> Impostare superiore (&quot;inizio&quot;) e inferiore (&quot;fine&quot;) di z-stack o serie. Successivamente, regolare la richiesta &quot;z-step size&quot;. <ol><li> Neisseria meningitidis è un diplococco (Figura 1G) e dal momento che ogni cocchi ha un diametro approssimativo di 0,5 micron, lo z-step dimensioni di 0,20 micron è stato scelto per aumentare le probabilità di scansione di ogni coccus almeno due volte. E &#39;anche all&#39;interno della dimensione del passo per la risoluzione ottimale di 0,1-0,2 micron. </li></ol></li><li> Impostare i parametri di scansione finale, selezionando la linea media del 3 per migliorare il rapporto segnale-rumore. </li><li> Facendo clic su &quot;start&quot; delle immagini a doppia o tripla macchiati sono ottenuti mediante la scansione sequenziale a diverse lunghezze d&#39;onda per eliminare cross-talk tra cromofori diversi. </li><li> Per avere un&#39;indicazione della colocalisation di due fluorocromi, selezionare la funzione &quot;overlay&quot; per unire i canali selezionati in una singola immagine, ad esempio, quando entrambi Alexa 488 (verde) e TRITC (rosso) fluorocromi colocalise, colore giallo apparirà l&#39;immagine sovrapposta . </li><li> Compila z-stack o serie con il &quot;massimo proiezione&quot; la funzione per la costruzione di un&#39;immagine 2D richiesto per la visualizzazione colocalisation possibile. Un&#39;analisi più dettagliata dei colocalisation può essere ottenuta con l&#39;analisi di ogni sezione ottica. </li><li> Dopo aver acquisito lo z-stack o una serie, i vostri dati per ottenere un&#39;immagine ortogonale per la visualizzazione della localizzazione intracellulare di vari elementi (figura 1E). </li></ol> 3. Quantificazione del Colocalisation L&#39;analisi statistica delle immagini microscopio confocale a scansione vengono eseguite con il software Volocity (improvvisazione, PerkinElmer). Questo software fornisce uno strumento progettato specificamente per l&#39;analisi colocalisation come descritto da Manders et al. (1993) 5. Colocalisation nel contesto del digital imaging di fluorescenza può essere descritto come il rilevamento di un segnale alla stessa voxel (volume pixel) in posizione di ogni canale. I due canali sono costituiti da immagini di due fluorocromi diversi presi dalla zona stesso campione (guida Volocity). Le analisi statistiche sono eseguite con il software Volocity (improvvisazione, PerkinElmer), utilizzando l&#39;analisi quantitativa Colocalisation descritto di seguito. Colocalisation analisi quantitativa <ol><li> Creare una libreria con le immagini CLSM usando il software Volocity. </li><li> Seleziona &quot;focus esteso&quot; dall&#39;immagine nella barra in alto. Questo strumento verrà compilato z-stack in un&#39;immagine 2D da analizzare. </li><li> Selezionare lo strumento &quot;colocalizzazione&quot;. I due canali da analizzare deve avere la stessa profondità di colore. </li><li> Selezionare l&#39;area che sta per essere quantificato. Impostare la soglia di rimuovere qualsiasi sfondo. </li><li> Creare l&#39;uscita colocalisation selezionando &quot;Genera colocalizzazione&quot;. Statistiche Colocalisation sono generati per le regioni di interesse selezionati in precedenza. </li><li> Seleziona Manders &#39;coefficienti R (coefficiente di sovrapposizione) e My (coefficiente colocalisation). <ol><li> Manders &#39;coefficienti non sono sensibili all&#39;intensità della colorazione in quanto sono normalizzati contro l&#39;intensità dei pixel totali; quindi possono essere impiegati quando la colorazione di un antigene è più forte rispetto agli altri. </li><li> Sovrapposizione R coefficiente secondo Manders 5,6 rappresenta il vero grado di colocalisation, cioè il numero di pixel che colocalise rispetto al numero totale di pixel. </li><li> D&#39;altra parte, il coefficiente di colocalisation, My, descrive il contributo fluorescenza della frazione più abbondante (in questo caso α-actinina, verde) per la frazione meno abbondante (in questo caso i batteri, rosso), cioè il numero di pixel rossi che si sovrappongono con pixel verdi rispetto al numero totale di pixel rossi. </li><li> Manders &#39;coefficienti compresi tra 1 e 0, dove 1 colocalisation alta, 0 non essere, ma che può essere espresso come percentuale per una più facile interpretazione. </li></ol></li><li> Statistiche di esportare i valori di un documento di Excel per la presentazione dei dati. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Localizzazione intracellulare di Opc che esprimono Neisseria meningitidis e α-actinina Confocale di cellule cerebrali umane microvascolari endoteliali infettate con Nm per 3 e 8 ore come sopra indicato colocalisation di α-actinina e Nm che sembrava essere meno frequenti in 3 esperimenti di infezione h (non mostrato) in confronto con culture infetti per 8 ore ( Figura 1 AF). Un colocalisation dimostrabili di α-actinina con Opc che esprimono meningococchi è stata osservata ogni volta in&gt; 5 esperimenti di replicare. L&#39;analisi statistica dei colocalisation utilizzando diverse immagini confocale è stata effettuata come descritto sopra. Complessivamente, nel HBMEC infettati con Opc che esprimono meningococchi,&gt; sovrapposizione del 25% del verde (α-actinina) e rosso (Nm) è stato ottenuto pixel (Figura 2B, Overlap coefficiente R). In contrasto con α-actinina, esperimenti in cui è stata effettuata l&#39;etichettatura di batteri e interiorizzato sia actina e vimentina, colocalisation occasionalmente è stata osservata con l&#39;actina, ma che con vimentina era rara (Figure. 2B). I dati sono stati analizzati utilizzando il coefficiente di mio, che prende in considerazione l&#39;abbondanza relativa di ogni porzione. La mia è una misura della frequenza di occorrenza del segnale più abbondante (in questo caso verde, α-actinina) ogni volta che il segnale meno abbondanti (in questo caso rosso, batteri) si verifica. Questa misura mostra un livello notevole di presenza di α-actinina nelle vicinanze di interiorizzate meningococchi (Figura 2 A e C). <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Microscopia confocale a scansione laser per valutare le interazioni intracellulari di N. meningitidis con α-actinina. AH. Monostrati confluenti endoteliali coltivate su vetrini sono stati infettati con il Opc che esprimono (AF) N. meningitidis. Dopo 8 ore, non aderente batteri sono stati lavati via, cellule fissate con paraformaldeide e permeabilised con 0,1% Triton X-100. Successivamente, i batteri e α-actinina sono state colorate come descritto in precedenza (α-actinina, verde, batteri, rosso). AC. Un campo che mostra le immagini xy della posizione del Nm (A) o α-actinina (B). L&#39;immagine in sovrapposizione (C) indica diverse regioni in cui colore giallo-arancio sembra suggerire colocalisation. Frecce (A) e (B) mostrano regioni in cui un alto grado di α-actinina accumulo sembra essere avvenuto intorno batteri. D. dissezione ottica di un infetto colocalisation monostrato HBMEC indicando intorno batteri intracellulari trova alla base di una cella. Di nuovo, questo colocalisation non è dovuto alla vicinanza accidentale di α-actinina, come il generale macchia di α-actinina in questa regione è basso. E e F. immagini tridimensionali di monostrati infettati HBMEC trattati come sopra. Una visione obliqua della superficie apicale (E) mostra i batteri aderenti macchiato di rosso (freccia rossa), mentre diversi batteri trova verso la superficie basale delle cellule endoteliali (freccia gialla) sono nettamente arancione / giallo a colori. Posizione basale può essere più chiaramente in (F), che è un fine-on XZ sezione trasversale. G. Un negativamente macchiato l&#39;immagine al microscopio elettronico di N. meningitidis mostrando il suodiplococcal predominante da. Ogni cocco è di circa 0,5 micron di diametro. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Localizzazione e distribuzione di α-actinina, actina e vimentina nelle cellule HBMEC. Monostrati A. infetti di HBMEC sono stati trattati come descritto nella leggenda sopra, ma in aggiunta a α-actinina, alcune lamelle sono stati utilizzati per la rilevazione di actina e vimentina con procedura analoga a quella di α-actinina. Come sopra, α-actinina concentrata intorno ad alcuni batteri interiorizzato (frecce bianche). Vimentina e actina non colocalise con i batteri a livelli apprezzabili. Bar rappresenta il 20 micron. B. &amp; C. I valori per i coefficienti di R e I miei sono stati ottenuti da più di tre esperimenti utilizzando il software Volocity come descritto sopra.

<ol>
	<li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells;+the+role+of+integrins+in+apical+interactions.">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li><li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells:+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides.">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li><li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin.">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li><li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells.">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images.">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La possibilità di legame di interiorizzate Opc che esprimono Neisseria meningitidis di α-actinina è stata esplorata utilizzando HBMEC per l&#39;esame della colocalisation di batteri e le proteine ​​del citoscheletro nelle cellule infette dopo 3 e 8 periodo di incubazione. Mediante microscopia confocale, colocalisation di Neisseria meningitidis con α-actinina potrebbe essere dimostrata. In particolare, anche se i batteri sono stati internalizzati in 3 ore, c&#39;era colocalisation po &#39;con α-actinina a questo punto del tempo. Associazione batterica con la proteina del citoscheletro hanno richiesto un lungo periodo di residenza intracellulare come dopo 8 h periodo di infezione, un numero significativo di batteri aveva α-actinina apparentemente in stretta associazione. Alfa-actinina è una proteina multifunzionale, e le interazioni batteriche con l&#39;elemento del citoscheletro potrebbe avere un&#39;influenza significativa sulla funzione delle cellule bersaglio, che è un oggetto di studi in corso. Quantificazione dei colocalisation come sopra descritto richiede una meticolosa preparazione del campione. Particolare attenzione dovrebbe essere data alla fissazione del campione, il blocco diluizioni periodo e anticorpi. Per il miglior rapporto segnale rumore, ogni anticorpo primario e secondario devono essere titolati in esperimenti preliminari per determinare le concentrazioni ottimali. Nella nostra esperienza, il Mowiol mezzo di montaggio prodotta immagini migliori.

1. Microscopia confocale a scansione laser (CLSM): Leica SP5 confocale sistema di imaging: Questo sistema, utilizzando una combinazione di AOTF (acusto-ottico filtro sintonizzabile) e un AOBS (acusto-ottico divisore di fascio), semplifica l&#39;eccitazione con lunghezze d&#39;onda specifiche. 2-Software: Leica confocale software LCS, Leica Microsystems, in Germania. Volocity 5, improvvisazione, PerkinElmer, USA.

visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging

La proteina Opc di Neisseria meningitidis (Nm, meningococco) è una superficie espressa proteina integrale della membrana esterna, che può agire come adesina e un invasin efficace per cellule epiteliali ed endoteliali. Abbiamo identificato endoteliali superficie situata integrine come recettori importanti per Opc, un processo che richiede Opc di legarsi prima a ligandi dell&#39;integrina come vitronectina e tramite questi alla cella-espresso recettori 1. Questo processo porta ad invasione batterica delle cellule endoteliali 2. Più di recente, abbiamo osservato una interazione di Opc con una proteina 100kDa trovato nei lisati cellulari totali di cellule umane 3. Inizialmente abbiamo osservato questa interazione quando le proteine ​​della cellula ospite separati mediante elettroforesi e cancellati a nitrocellulosa sono stati sovrapposti con Opc che esprimono Nm. L&#39;interazione è diretta e non coinvolgono le molecole intermedie. Mediante spettrometria di massa, abbiamo stabilito l&#39;identità della proteina α-actinina. Poiché non sono superficie espressa α-actinina è stato trovato su una delle linee di cellule otto esaminati, Opc e le interazioni con le cellule endoteliali in presenza di piombo nel siero all&#39;ingresso batteriche nelle cellule bersaglio, abbiamo esaminato la possibilità che le due proteine ​​interagiscono intracellulare. Per questo, colta cervello umano le cellule endoteliali microvascolari (HBMECs) sono stati infettati con Opc, che esprimono Nm per lunghi periodi e le località di batteri internalizzati e α-actinina sono stati esaminati al microscopio confocale. Abbiamo osservato tempo-dipendente aumento della colocalisation Nm con le proteine ​​del citoscheletro, che è stato notevole dopo un periodo di otto ore di internalizzazione batterica. Inoltre, l&#39;uso di software di imaging quantitativa ci ha permesso di ottenere una misura relativa della colocalisation di Nm con α-actinina e di altre proteine ​​del citoscheletro. Qui vi presentiamo un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle colocalisation del batterio con le proteine ​​intracellulari dopo l&#39;entrata batterica in cellule endoteliali umane, anche se la procedura è applicabile anche alle cellule epiteliali umane.

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), un grammo negativo umano-specifici patogeni respiratori, possono legarsi ai umano α-actinina. Qui vi presentiamo un protocollo per la visualizzazione di colocalisation del batterio intracellulare con α-actinina dopo l&#39;entrata batteriche nelle cellule umane endoteliali microvascolari cerebrali (HBMECs).

Visualizzazione e quantificazione delle interazioni intracellulari di Neisseria meningitidis E umano α-actinina da Imaging confocale

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

18.0K Views.  University of Bristol, UK. Neisseria meningitidis (Nm), un grammo negativo umano-specifici patogeni respiratori, possono legarsi ai umano α-actinina. Qui vi presentiamo un protocollo per la visualizzazione di colocalisation del batterio intracellulare con α-actinina dopo l'entrata batteriche nelle cellule umane endoteliali microvascolari cerebrali (HBMECs).

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Misure singole cellule di Rottura Vacuolar causate da patogeni intracellulari

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

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Immunologia e infezioni

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Scoperta di nuovi agenti patogeni intracellulari da amoebal co-coltura e approcci amoebal arricchimento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

Sonde ottiche Screening di nuovi batteri specifici sul tessuto polmonare umano Ex Vivo di endomicroscopia confocale Laser

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex Vivo Infezione della Mucosa genitale umana del tessuto linfoide e donna con il Virus dell'immunodeficienza umana 1 e Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...