Vorremmo ringraziare Ying Yu per Apc Min / + topi genotipizzazione. Questo studio è stato sostenuto da fondi provenienti da INSERM e sovvenzioni (CA057621 e AI053194) dal National Institutes of Health.

NOTA: Tutti gli esperimenti su animali sono stati condotti in conformità con le procedure approvate dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC), UCSF. Tutti gli esperimenti di imaging sono procedure non-sopravvivenza e gli animali sono stati sacrificati immediatamente successivo alla fine della acquisizione delle immagini. 1 Generazione di topi NOTA: Apc Min / + topi, che trasportano una mutazione sul gene Apc, sviluppano spontaneamente 50-100 adenomi nel piccolo intestino. <ol><li> Croce Apc Min / + topi con la linea ACTB-ECFP, che esprime ECFP sotto il promotore actina, e in seguito con la linea c-fms-EGFP, che esprime EGFP sotto il c-fms promotore per rilevare le cellule mieloidi. Animali eterozigoti per ACTB-ECFP e c-fms-EGFP sono utilizzati per rilevare la fluorescenza. </li><li> Utilizzare i topi a 3-4 mesi di età per immagine adenomi chiaramente rilevabili. </li></ol> 2 Preparazione di Materiali prima dell&#39;intervento chirurgico NOTA: I dettagli del microscopio set-up sono stati precedentemente descritto 6,7. <ol><li> Microscopio <ol><li> Accendere la coperta di riscaldamento. Accendere il laser ad argon per 488 nm di eccitazione e lo stato solido 405 nm, 561 nm e 640 nm laser. Accendere il microscopio, la centralina disco rotante, la AOTF, l&#39;unità di controllo laser, e il controller della telecamera. </li><li> Aprire l&#39;otturatore microscopio, che trasforma il LED rosso. Accendere il software per computer e la macchina fotografica. </li></ol></li><li> Imaging Platform <ol><li> Assicurarsi che l&#39;inserto fase è pulito. In caso contrario, pulire con acqua e sapone e poi asciugare. </li><li> Prendete due coprioggetto e utilizzare il nastro di laboratorio per garantire la loro sull&#39;inserto. Collocare l&#39;inserto sul palco e pulirlo con cotone imbevuto di alcol. </li><li> Con del nastro di laboratorio, fissare la coperta di riscaldamento sul lato destro del palco. </li><li> Verificare l&#39;integrità della membrana in gomma sul cono naso e cambiarlo se necessary. Posizionare e fissare il cono per la consegna anestesia isoflurano per l&#39;animale utilizzando una garza e nastro di laboratorio. </li></ol></li><li> Isoflurano Anestesia sistema <ol><li> Riempire il serbatoio isoflurano. </li><li> Accendere il vuoto e regolare a 1,2 L / min. </li><li> Aggiungere acqua distillata per il nebulizzatore e collegare il nebulizzatore al sistema di isoflurano. </li><li> Accendere l&#39;analizzatore di ossigeno e collegarlo al sistema di isoflurano. Accendere la bombola di ossigeno e assicurarsi che l&#39;analizzatore di ossigeno mostra 100%. Regolare il flusso di O 2 a 0,2 L / min. </li><li> Accendere il serbatoio di azoto e regolare il flusso a 0,8 L / min. Accertarsi che l&#39;analizzatore di ossigeno mostra 21%. </li></ol></li><li> Preparazione di strumenti di chirurgia e Platform <ol><li> Pulire le 2 coppie di pinze e forbici dissezione con acqua e sapone. </li><li> Accendere il tallone sterilizzatore caldo e lasciarlo raggiungere i 250 ° C. Sterilizzare gli strumenti di chirurgia per 30 sec. Lasciateli raffreddare. </li><li> Posizionare un soaker laboratorio in panchina chirurgia. </li><li> Utilizzare un coperchio di polistirolo come piattaforma chirurgica. Coprire con un pezzo di laboratorio soaker. Preparare un secondo pezzo di laboratorio soaker a cambiare dopo la rasatura con il mouse. </li><li> Posizionare il cono con la linea di anestesia sul coperchio di polistirolo coperto, e collegarlo al coperchio di polistirolo (non sul soaker laboratorio) con del nastro e usare due aghi su entrambi i lati del cono per tenerlo in posizione. </li><li> Assemblare betadine, cotone imbevuto di alcol, garze sterili, colla super, vetrini da microscopio, rasoio elettrico, e 4 pezzi di nastro di laboratorio. </li></ol></li></ol> 3 Preparazione di iniezioni <ol><li> Sotto il cofano, preparare una siringa da insulina (28 G x ½ in) con 7 ml di brodo AF647-coniugato Ly-6G (Gr1) anticorpo (1 mg / ml) in 100 ml di 2.000 kDa rodamina-destrano (4 mg / ml ) per iniezione retro-orbitale. Iniezione retro-orbitale è raccomandato in Apc Min / + topi in quanto l&#39;anemia che si sviluppa in questi animali rende la vene coda difficult per rilevare attraverso la pelle. </li><li> Preparare una seconda siringa da insulina con 1 mg / kg di atropina diluito in 150 microlitri di PBS per via sottocutanea (sc) iniezione prima di imaging per smorzare i movimenti peristaltici dell&#39;intestino. </li></ol> 4 Preparazione della Intestino for Imaging <ol><li> Verificare che la linea di anestesia per la camera di induzione è aperta, e le linee al tavolo operatorio e il microscopio sono chiusi. </li><li> Trasferire l&#39;animale alla camera di anestesia. Chiudere la camera di anestesia e accendere il isoflurano al 4% (con il 21% O 2). </li><li> Quando il mouse respira profondamente e lentamente (dopo 5-6 min), trasferirlo alla fase chirurgica sul suo fianco e iniettare la soluzione di anticorpi Gr1 e / o soluzione di destrano retro-orbitale. </li><li> Aprire la linea anestesia collegati alla piattaforma chirurgica. Chiudere la linea alla camera di anestesia e mettere il mouse sulla sua schiena con il naso nel cono anestesia. </li><li> Ridurre l&#39;isofluranoconcentrazione dal 4% al 2,5%. </li><li> Verificare che il mouse è ben anestetizzato pizzicando la sua zampa e test del riflesso corneale. </li><li> Aggiungi oftalmico lubrificante unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Fissare le membra del mouse per la fase chirurgica con l&#39;aggiunta di nastro laboratorio. </li><li> Rimuovere il pelo dalla superficie ventrale utilizzando un rasoio elettrico. Rimuovere anche i capelli dalla arto posteriore sinistro per posizionare il saturimetro prima dell&#39;acquisizione. Rimuovere il soaker laboratorio dalla fase chirurgica e sostituirlo con uno pulito per evitare la contaminazione dei capelli. </li><li> Disinfettare la superficie ventrale con cotone imbevuto di alcol e betadine. </li><li> Iniettare la soluzione di atropina (da 3.2) SC in un fianco del mouse. </li><li> Fai da 1 cm ventrale incisione mediana attraverso la pelle e il peritoneo da utilizzando forbici e un paio di pinze. Estrarre delicatamente 3-4 cm di intestino e di individuare uno o più tumori all&#39;immagine. </li><li> Prendete un bicchiere microscope scivolo e la posizione un&#39;ansa dell&#39;intestino su di esso con un tumore in alto. </li><li> Aggiungete un po &#39;di colla super per un paio di posizioni lungo l&#39;intestino per fissarlo alla diapositiva. Attendere un minuto per asciugare la colla. Usare un pennarello per disegnare una linea nella diapositiva che punta al tumore, al fine di agevolarne la localizzazione con il confocale. </li></ol> 5 Posizionamento del mouse sullo stage e preparazione per Image Acquisition <ol><li> Rimuovere il nastro di laboratorio dalle membra. </li><li> Aprire la linea di anestesia alla fase microscopio e chiudere quello alla piattaforma chirurgica. </li><li> Trasferire il mouse con attenzione alla fase microscopio con il lato ventrale verso il basso e il naso nel cono di naso. Fissare la linea di anestesia con del nastro di laboratorio. </li><li> Ri-posizionare il mouse e / o la slitta in modo da avere l&#39;intestino al centro di una delle finestre di copertura-scivolato. Nastro delicatamente il vetrino con nastro di laboratorio. </li><li> Fissare la sonda saturimetro per l&#39;arto sinistro del mouse perseguire il suo cuore e livelli di frequenza e di saturazione di ossigeno arterioso respiratorie. </li><li> Coprire il mouse con la coperta di riscaldamento per evitare l&#39;ipotermia. </li><li> Diminuire la concentrazione di isoflurano dal 2,5% al ​​1-1,5% per l&#39;imaging. </li></ol> 6 Acquisizione di immagini mediante μManager Software <ol><li> Aumentare la velocità CSUX a 2.500 giri per migliorare la qualità dell&#39;immagine nelle impostazioni di configurazione. </li><li> Utilizzare il menu a discesa Obiettivo per scegliere 10X 0.5 NA o 20X 0,75 NA Fluar lente dell&#39;obiettivo. </li><li> Scegli il laser 405 nm dal menu a tendina colore. </li><li> Fare clic su Live e regolare la messa a fuoco con il microscopio. </li><li> Fare clic su Automatico per regolare automaticamente le intensità massime e minime in pixel dell&#39;immagine del display in base ai valori dei pixel estremi dell&#39;immagine. Un istogramma di intensità dei pixel dell&#39;immagine display è presentato nel grafico nella parte inferiore della finestra principale. </li><li> Regolare l&#39;esposizione della fotocamera nella finestra Pannello di controllo Piper dacambiando il numero di orologi (Un orologio è 33,333 msec). </li><li> Se il segnale è troppo luminosa con l&#39;esposizione più bassa, diminuire l&#39;intensità del laser con l&#39;unità di controllo del microscopio. </li><li> Verificare l&#39;intensità del segnale di 488 nm, 561 nm e 640 nm linee laser. Regolare intensità del laser con propria unità del laser di controllo (488 nm e 561 nm) o l&#39;unità di controllo del microscopio. </li><li> Nella finestra Multi D Acquisizione, selezionare la casella punti di orario e digitare il numero di punti di tempo e l&#39;intervallo di tempo desiderato. </li><li> Selezionare la casella di Z-stack, scegliete &quot;Z relativo&quot; e definire Z-start e Z-end rispetto alla posizione attuale. NOTA: Per 10X o 20X obiettivo, iniziare con 3 piani Z, 8 micron o 4 micron a parte, rispettivamente. </li><li> Selezionare la casella posizioni multiple (XY) per l&#39;imaging diverse località, quindi fare clic su Modifica elenco posizione, segnare 4-6 posizioni diverse. </li><li> Selezionare la casella Canali e aggiungere canali da New e selezionare laser linee dal menu a discesa e tipe in esposizione per ogni canale (in multipli di 33.333 msec). </li><li> Controllare Salvare le immagini nella finestra &quot;acquisizione Multi D&quot;. </li><li> Selezionare una cartella e tutte le immagini acquisite vengono salvate automaticamente in questa cartella con il prefisso del nome dato. NOTA: Ogni continua acquisizione verrà salvato in una sottocartella separata come file TIFF individuali per ogni fetta Z in ogni colore in ogni punto. </li><li> Salvare tutte le impostazioni, fare clic su Salva impostazioni nella finestra Multi D acquisizione. </li><li> Fare clic su Acquisisci nella finestra Multi-dimensionale di acquisizione per avviare l&#39;acquisizione. </li><li> Se la sonda ossimetro non è utilizzato o smette di funzionare bene (quando l&#39;impulso non è stabile o difficile da individuare), controllare l&#39;efficienza di anestesia ogni 15 minuti durante la procedura di imaging pizzicando la zampa e il controllo del riflesso corneale. Regolare i anestesia se il mouse è sensibile a questi stimoli. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione, eutanasia il mouse aumentando la concent isofluranorazione al 5%. Quando non movimenti respiratori sono rilevabili, togliere il mouse dal palco ed eseguire una dislocazione cervicale. </li></ol> 7 Analisi di immagini mediante Imaris Software <ol><li> Conversione in .ims file (supplementari Figura 1A) <ol><li> Aprire il software della fotocamera, fare clic su File quindi Batch Converter. </li><li> Fare clic su Aggiungi file e selezionare il primo file della prima posizione. Ripetere l&#39;operazione per ciascuna posizione. </li><li> Per ogni file caricato, fare clic su Impostazioni e verificare che le impostazioni &quot;T&quot; per il tempo, &quot;c&quot; per i canali e &quot;z&quot; per Z-stack appaiono in questo ordine. </li><li> Salva nella cartella desiderata. Sfoglia e creare un nuovo file convertito. </li><li> Fare clic su Imposta per tutti e Start. </li></ol></li><li> Regolazioni (complementare Figura 1B) <ol><li> Andate nella cartella convertito specifica e aprire il primo file. </li><li> Nella finestra di regolazione del display, regolare il fondosegnale cutoff modificando il numero minimo per ciascun canale, se necessario. </li><li> Se necessario, regolare l&#39;intensità del segnale modificando il numero massimo (minore è il numero massimo, maggiore è l&#39;intensità del segnale). NOTA: Le regolazioni del segnale intensità / contrasto consentono il punto culminante di un comportamento cellulare o di un vano in modo da avere una visualizzazione più piacevole. Questo non cambia il risultato stesso. </li><li> Fare clic su Modifica e proprietà immagine. </li><li> Modificare le x, y, z e valori (per un obiettivo 10X, x e y = 0,712, z = 8 micron, per un obiettivo 20X: x e y = 0.36, z = 4 micron). </li><li> Clicca su tutti equidistanti per regolare punti di tempo. Aggiungere la data di inizio e l&#39;ora di acquisizione iniziare. Aggiungere la data di fine e la fine di acquisizione (complementare Figura 1C). </li><li> Fare clic sul pulsante Play per guardare il film. </li><li> Fare clic su Modifica e Elimina punti di tempo per cancellare le immagini sfocate. </li><li> Per unire due acquisizioni separate Together in un film, andare all&#39;ultimo punto di volta del primo film e fare clic su Modifica&gt; Aggiungi punti di tempo per aggiungere il secondo file. </li></ol></li><li> Salvataggio di un filmato (complementare Figura 1D) <ol><li> Fare clic su Masterizza, selezionare l&#39;estensione mov e un fattore di compressione di 0. </li><li> Fare clic su Salva. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In questo lavoro, un protocollo dettagliato è descritto per la filatura del disco confocale delle dinamiche di cellule mieloidi in tumori intestinali per diverse ore in un animale vivo, ripresa dal lato sierosa dell&#39;intestino. Per evitare l&#39;infiammazione e di avere condizioni fisiologiche ottimali, imaging dell&#39;intestino deve essere fatto sull&#39;organo intatta. Tuttavia, l&#39;imaging dal lato sierosa dell&#39;intestino è impegnativo, poiché la luce deve passare attraverso d...

Prove schiaccianti ora dimostra che il microambiente tumorale, costituito da popolazioni cellulari eterogenee, inclusi i fibroblasti, cellule endoteliali, cellule immunitarie e infiammatorie, matrice extracellulare e fattori solubili, svolge un ruolo cruciale nella iniziazione e progressione dei tumori solidi contribuendo a quasi tutti caratteristiche di cancro 1. Infatti, durante la progressione del tumore, ci sono costanti interazioni dinamiche tra cellule tumorali trasformate e le cellule stromali che si evolvono per generare un microambiente favorevole alla malignità 2. Tra le cellule immunitarie che infiltrano il microambiente tumorale, le cellule mieloidi sono i più abbondanti 3. Composto da macrofagi associati al tumore (TAM), derivati ​​da cellule mieloidi soppressore (MDSCs), cellule dendritiche (DC) e neutrofili (PMN), le cellule mieloidi sono reclutati dal midollo osseo e progressivamente si infiltrano i tumori, rilasciando citochine, fattori di crescita e proteasi che può promuoverela crescita del tumore e la diffusione 4. Il crosstalk tra le cellule tumorali e le cellule mieloidi è complessa ma dinamica. Così la comprensione della natura delle loro interazioni è fondamentale per determinare il motivo per cui queste cellule favoriscono la progressione del cancro, invece di partecipare a una risposta immunitaria anti-tumorale, e può aiutare a trovare nuovi obiettivi per controllarlo. L&#39;osservazione diretta al microscopio intravitale fornisce informazioni sulle dinamiche delle cellule all&#39;interno dei tessuti di topi vivi 5. A quattro colori, multi-regione, disco rotante micro-lensed sistema confocale è stato progettato per studiare le cellule stromali all&#39;interno di tumori mammari 6. Questo approccio consente di imaging continuo a lungo termine e comprende diversi vantaggi, come (a) acquisizione immagini rapide per ridurre al minimo gli artefatti da movimento, (b) l&#39;anestesia-lungo termine, (c) l&#39;acquisizione di quattro colori di seguire diversi tipi di cellule, (d) l&#39;etichettatura fluorescente delle diverse componenti tumorali, e (e) l&#39;osservazione di diversi microambienti tumorali within lo stesso mouse per evitare il mouse per variabilità del mouse 7-9. Con questa tecnologia, i comportamenti cellulari diversi sono stati riportati nel virus del tumore mammario (MMTV) promotore-driven polioma middle T oncogene (PyMT) modello che mostra le fasi progressive della tumorigenesi. Regolamentazione linfociti T (Tregs, visualizzati dal transgene Foxp3 EGFP) migrare preferenzialmente in prossimità di vasi sanguigni che il DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblasti carcinoma-associata (Fsp1 + / + -EGFP) e cellule mieloidi (c-fms -EGFP) presentano elevata motilità alla periferia del tumore rispetto all&#39;interno della massa tumorale. Nella condizione di ipossia sistemica acuta, le cellule migrate in modo diverso: Tregs fermare la migrazione al contrario di cellule mieloidi che continuano a muoversi 6. Inoltre, nello stesso modello di topo, è stato dimostrato che le variazioni di sensibilità doxorubicina con stadio tumorale, distribuzione del farmaco è legato alla risposta ai farmaci, e doxorubicinatrattamento porta al reclutamento CCR2-dipendente delle cellule mieloidi ai tumori. Così, l&#39;imaging dal vivo può essere utilizzato anche per acquisire conoscenze in risposta ai farmaci in situ e la biologia di chemioresistenza 10,11. Poliposi adenomatosi coli (APC) mutazioni del gene comunemente si verificano in adenomi colorettali umani e carcinomi 12 e mutazione di una singola copia dei risultati gene APC nella poliposi adenomatosa familiare (FAP), che conferisce un altissimo rischio di cancro al colon 13. Il ceppo di topi Apc Min / + porta una mutazione troncamento al codone 850 del gene Apc e si sviluppa spontaneamente più adenomi intestinali tutto il piccolo intestino da 14 a 16. A lungo termine intravitale imaging dell&#39;intestino è impegnativo a causa della invasività della procedura, poiché l&#39;apertura della cavità peritoneale è necessaria per l&#39;accesso a livello intestinale. A breve termine l&#39;imaging dal vivo studies sono stati precedentemente pubblicati sulla salute dell&#39;intestino 17,18, ma l&#39;osservazione diretta a lungo termine dei tumori intestinali non è stato riportato. Una procedura chirurgica è stato progettato e perfezionato per visualizzare i tumori attraverso la superficie sierosa dell&#39;intestino, utilizzando il sistema di microscopia a disco rotante intravitale precedentemente utilizzato per i tumori della mammella immagine 6,10. In questo lavoro, un protocollo è descritto che permette di seguire il comportamento delle cellule mieloidi all&#39;interno dei tumori del piccolo intestino utilizzando Apc Min / + topi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ApcMin/+ mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td>2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ACTB-ECFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:141px;">3773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cfms-EGFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td align="right">18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">D7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:107px;">Butler Animal Health Supply</td>
			<td style="width:141px;">29450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxygen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1X PBS</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Saline Buffer</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td>
			<td style="width:107px;">UCSF Monoclonal antibody core</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Use at 1mg/Kg mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">28G1/2 insulin syringe</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">329465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Remium cover glass</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-548-5M</td>
			<td>24x50-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost plus microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-550-15</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Krazy glue</td>
			<td style="width:107px;">Office Max</td>
			<td align="right">7111555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Betadine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heat blanket</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar Industries</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:107px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">18000-45</td>
			<td>Turn ON 30min before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cotton tipped apllicators 6-inch</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">72310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anesthesia system</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss Inc</td>
			<td style="width:141px;">Zeiss Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">stage insert</td>
			<td style="width:107px;">Applied Sientific Instrumentation</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse Ox oximeter, software and sensors</td>
			<td style="width:107px;">Starr Life Sciences</td>
			<td style="width:141px;">MouseOx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nebulizer</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaris</td>
			<td style="width:107px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mManager</td>
			<td style="width:107px;">Vale lab, UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Open-source software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ICCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:141px;">XR-Mega-10EX S-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spinning disk confocal sacan-head</td>
			<td style="width:107px;">Yokogawa Corporation</td>
			<td style="width:141px;">CSU-10b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

Cellule mieloidi sono i più abbondanti cellule immunitarie all&#39;interno di tumori e hanno dimostrato di promuovere la progressione tumorale. Le moderne tecniche di imaging intravitale permettono l&#39;osservazione del comportamento cellulare dal vivo all&#39;interno dell&#39;organo, ma può essere difficile in alcuni tipi di cancro a causa di organo e tumore accessibilità, come l&#39;intestino. L&#39;osservazione diretta dei tumori intestinali non è stato segnalato in precedenza. Una procedura chirurgica qui descritta permette l&#39;osservazione diretta delle dinamiche di cellule mieloidi all&#39;interno dei tumori intestinali nei topi dal vivo utilizzando topi transgenici reporter fluorescente e traccianti iniettabili o anticorpi. A questo scopo, è stato utilizzato un quattro-colore, multi-regione, disco rotante microscopio confocale micro-lensed che consente a lungo termine di imaging continuo con l&#39;acquisizione rapida di immagini. Apc Min / + topi che sviluppano più adenomi nel piccolo intestino è attraversato con i topi c-fms-EGFP per visualizzare le cellule mieloidi e con i topi ACTB-ECFPper visualizzare le cellule epiteliali intestinali delle cripte. Sono inoltre descritte le procedure per etichettare diversi componenti tumorali, come i vasi sanguigni e neutrofili, e la procedura per il posizionamento del tumore per l&#39;imaging attraverso la superficie sierosa. Filmati time-lapse compilati da diverse ore dell&#39;imaging consentono l&#39;analisi del comportamento delle cellule mieloidi in situ nel microambiente intestinale.

Utilizzando filatura disco microscopia confocale, tessuti non tumorali e tumorali nel piccolo intestino di Apc Min / +; ACTB-ECFP; topi c-fms-ECFP possono essere visualizzati dalla superficie sierosa. Dopo l&#39;imaging, software della fotocamera viene utilizzato per analizzare e regolare l&#39;acquisizione (Figura supplementare 1). Dopo endovenosa (iv) l&#39;inserimento di fluorescenza 2.000 kDa destrano-rodamina e un anticorpo coniugato Ly-6G 647, vasi sanguigni e...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy at JoVE.com

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K Views.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

Video: Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analisi di<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.

RNA del Virus di febbre rompiossa nel supernatante di coltura delle cellule infettate da reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale di misurazione