Questo lavoro è stato finanziato dalla Agence Nationale pour la Recherche e dal Consiglio europeo della ricerca.

Il test funziona in vari formati, tuttavia si consiglia di scalare verso il basso il volume del campione per salvare i reagenti, in particolare CCF4-AM. Pertanto, la seguente protocollo è descritto per le cellule HeLa fisse o THP-1 i macrofagi in un formato a 96 pozzetti, poi per cellule HeLa vivi nel 35 millimetri piatti fondo di cristallo. Il dosaggio può essere adattato per altri patogeni. Oltre infezione Shigella, descriviamo il test per THP-1 phagocytosing diversi m y ceppi cobacterial. È importante sottolineare che, dopo CCF4-AM carico, tutti i reagenti e tamponi tra cui buffer di lavaggio richiedono la presenza di probenecid a 1 mm. Probenecid è un inibitore canale anionico che favorisce la ritenzione citosolico di CCF4 durante tutte le fasi del protocollo. Campioni fissati dovranno essere acquisite entro poche ore dopo l&#39;esperimento in quanto il segnale CCF4 non è stabile per lunghi periodi di tempo. 1. CCF4 Assay su campioni fissati con Shigella flexneri (96 pozzetti) <ol><li> Preparazione di batteri per le culture durante la notte. Inoculare i batteri pre-culture di tipo selvatico (M90T Afai) e mutanti (BS176 Afai) ceppi 1 giorno prima infezione in 8 ml trittico caseina di soia brodo (TCSB) integrato con ampicillina (50 mg / ml) in un agitatore a 37 ° C per una notte . </li><li> Cellule placcatura per l&#39;infezione. Seme cellule HeLa in piastre da 96 pozzetti 1 giorno prima dell&#39;infezione a una densità di 5 x 10 3 cellule per pozzetto in DMEM contenente 10% siero fetale bovino (FCS) e 1% di penicillina-streptomicina in un 5% di CO 2 incubatore in un volume finale di 100 microlitri. Nel caso di cellule THP-1 macrofaghe, placcatura cella viene effettuata 2 giorni prima dell&#39;infezione a una densità di 5 x 10 4 cellule / pozzetto, ed essi vengono incubati con 30 nM Phorbol miristato acetato (PMA) in RPMI contenente 10% Fetal Calf Serum (FCS), 1% di penicillina-streptomicina e 0,05 mM di 2-mercaptoetanolo. </li><li> Preparazione di batteri per sottocultura. Inoculare colture batteriche durante la nottea una diluizione in TCSB 1/100 integrata con 50 ug / ml di ampicillina in un agitatore a 37 ° C per 2,5 hr (OD600 = 0,3 a 0,4). </li><li> Celle di carico con CCF4-AM. Preparare la miscela CCF4-am carico per un volume finale di 25 pl per pozzetto contenente 1 mM probenecid (Sigma), 1,5 mM CCF4-AM (6 mM nel caso di THP-1) e 1,25 ml di soluzione di carico B (100 mg / ml Pluronic-F127 tensioattivo in acido acetico DMSO/0.1% prevista lungo CCF4-AM LiveBlazer Caricamento Kit da Invitrogen) in EM tampone (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM di glucosio, HEPES 25 mM a pH 7.3). Lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere 25 ml di CCF4-AM carico della miscela per bene a temperatura ambiente al buio per 2,5 ore. </li><li> Preparazione di batteri per l&#39;infezione. Spin 1 ml di sottoculture batteriche a 9.000 rpm per 1 min. Lavare una volta con 500 microlitri di PBS, centrifugare a 9000 rpm per 1 min e risospendere in 500 microlitri di PBS addizionato con 10 mg / ml di poli-L-lisina (Sigma) e 40 mcg / ml β-lattazionemase (Sigma). Dopo 10 min di incubazione su una ruota girevole a temperatura ambiente, lavate una volta con 500 microlitri di PBS e batteri risospendere in 500 microlitri tampone EM / 1 mM probenecid. </li><li> Infezione delle cellule e la fissazione. Lavare le cellule una volta con 150 microlitri di PBS / 1 mM probenecid, preparare una miscela di 10 ml di batteri risospese in un volume finale di 100 microlitri di tampone EM / 1 mM probenecid e distribuirlo a ciascun pozzetto. Dopo 15 min di incubazione al buio a temperatura ambiente, passare la piastra a 37 ° C per 1 ora (90 minuti nel caso di THP-1), lavare con 150 microlitri di PBS / 1 mM probenecid e fissare con 50 microlitri paraformaldeide 4% / 1 mM probenecid per 10 minuti al buio. Poi, lavare con 150 microlitri di PBS / 1 mM probenecid, incubare per 30 minuti con 30 ml di 10 mM nuclei colorante DRAQ5 (Biostatus), lavare con 150 microlitri di PBS / 1 mm probenecid e lasciare i campioni in 100 l di PBS / 1 mm probenecid. </li><li> Impostazioni di acquisizione dei campioni fissi. Acquisizione viene effettuata sia mediante (i) un epifluorescenza micros invertitafar fronte a un 20x (0,5 Apertura numerica (NA), 2.1 Distanza di lavoro (WD)) o 40x (0.75 NA, 0,72 WD) Obiettivo aria N-Plan o (ii) utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 10x. Imaging di fluorescenza viene eseguita con eccitazione a 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) ed emissione rilevata tramite 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) e 535 nm (filtri Semrock, FF01-520/35- 25) con tempi di esposizione di 5 msec (luce trasmessa), 1.000 msec (535 nm) e 500 msec (450 nm). Confocale viene eseguita utilizzando il seguente tempo di esposizione: 240 msec (450 nm) e 360 ​​msec (535 nm) per il laser 405 nm (870 μW), 640 msec (DRAQ5) per il laser 640 nm (2560 μW). </li><li> L&#39;analisi post-acquisizione. Successivamente, le immagini vengono analizzate da un algoritmo che consente analisi automatica del segnale di fluorescenza per ogni singole celle. Software come Metamorph 7.1 o Acapella può essere usato per creare uno script per misurare il rapporto tra i segnali di emissione 450nm e 535nm (su richiesta). Di nota, l&#39;uso di un dispositivo di calibrazione fuoco accoppiata alla microscopia automatizzata durante l&#39;acquisizione permette acquisire decine di posizioni differenti in pozzi multipli contemporaneamente. </li></ol> 2. CCF4 Assay su campioni dal vivo grazie Shigella flexneri (formato 35 mm con fondo di vetro, MatTek) <ol><li> Preparazione di batteri per le culture durante la notte. Procedere come descritto in precedenza. </li><li> Cellule placcatura per l&#39;infezione. Seed cellule HeLa in 35 millimetri di vetro con fondo piatti della cultura (MatTek 10 millimetri Microwell, MatTek società) 1 giorno prima infezione ad una densità di 2 x 10 5 cellule / piatto in un volume finale di 2 ml. </li><li> Preparazione di batteri per sottocultura. Procedere come descritto in precedenza. </li><li> Celle di carico con CCF4-AM. Preparare la miscela carico CCF-AM come precedentemente descritto per un volume finale di 2 ml per piastra. Prima del carico, lavare le cellule una volta con PBS. </li><li> Preparazione di batteri per l&#39;infezione. Procedere come descritto in precedenza. </li><li> Acquisizimpostazioni di ioni di campioni vivi. Acquisizione avviene per 60 min ogni 90 sec con un microscopio a epifluorescenza invertito utilizzando un 20x (0,5 NA, 2.1 WD) o un (NA 0,75, 0,72 WD) obiettivo aria N-Plan 40x all&#39;interno di un 37 ° C camera di riscaldamento. Imaging di fluorescenza viene eseguita con eccitazione a 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) ed emissione rilevata tramite 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) e 535 nm (filtri Semrock, FF01-520/35- 25) con tempi di esposizione di 5 msec (luce trasmessa), 200 ms (535 nm) e 100 msec (450 nm). </li><li> Infezione delle cellule e l&#39;acquisizione diretta. Lavare le cellule una volta con 2 ml di PBS / 1 mM probenecid, aggiungere 2 ml di EM / 1 mM probenecid, montare il piatto sul palco del microscopio e avviare l&#39;acquisizione. Dopo 6 min (punto 4 tempi), ha messo l&#39;acquisizione in attesa, aggiungere 250 ml di batteri risospensione in cima alle cellule e riavviare l&#39;acquisizione. </li><li> L&#39;analisi post-acquisizione. I filmati possono essere visualizzati utilizzando Metamorph o ImageJ. 450/535 rapporti di intensità nm per ogni individoppia cella può essere ottenuto utilizzando ImageJ. Come accennato in precedenza, l&#39;uso di un dispositivo di calibrazione fuoco accoppiata alla microscopia automatizzata durante l&#39;acquisizione permette acquisendo molteplici posizioni diverse a seconda del tempo-intervallo. </li></ol> 3. CCF4 Assay su campioni fissati con Micobatteri (96 Well Format) <ol><li> Preparazione di batteri. Crescere ceppi di micobatteri a metà fase log in 7H9 contenenti destrosio albumina catalasi (ADC) a 30 ° C (per Mycobacterium marinum) o 37 ° C (per il Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis). </li><li> Cellule placcatura per l&#39;infezione. Piastra THP-1 macrofagi 2 giorni prima infezione li dell&#39;incubazione con 30 nM PMA in RPMI contenente 10% siero fetale bovino (FCS), 1% di penicillina-streptomicina e 0,05 mM 2-mercaptoetanolo in un 5% di CO 2 incubatore in un volume finale di 100 pl ad una densità di 5 x 10 4 cellule / pozzetto. </li><li> Preparazione di batteri per l&#39;infezione. Harvculture est, lavare e sospendere nuovamente con PBS prima di sonicazione e filtrazione attraverso una siringa per evitare grumi. Determinare la concentrazione di ciascun ceppo mediante misurazione OD600 e infettare cellule THP-1 ad una MOI di 01:01 a 30 ° C (per Mycobacterium marinum) o 37 ° C (per Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis) in mezzo RPMI con il 5% CO 2. Dopo 2 h, togliere medie, lavare 3 volte con PBS e aggiungere mezzo fresco completo per 1 a 2 giorni (nel caso di Mycobacterium marinum) o 3 a 7 giorni (nel caso di Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis). </li><li> Caricamento di cellule con CCF4-AM e la fissazione. Lavare le cellule una volta con PBS e preparare il CCF4-AM mix caricamento come precedentemente descritto per un volume finale di 25 pl per pozzetto utilizzando un CCF4-AM concentrazione finale di 6 mM. Caricamento in corso avviene a temperatura ambiente al buio per 2 ore prima di lavare con 150 microlitri di PBS / 1 mm probenecid e fissarezione utilizzando 50 ml di paraformaldeide al 4% completato con1 mM probenecid per 30 min al buio. Poi, lavare con 150 microlitri di PBS / 1 mm probenecid e lasciare i campioni in 100 l di PBS / 1 mm probenecid. </li><li> Impostazioni di acquisizione e analisi post-acquisizione. Procedere come precedentemente descritto nel primo paragrafo utilizzando Shigella flexneri. </li></ol> Protocollo supplementare Saggi fluorimetriche vengono eseguiti per verificare l&#39;attività β-lattamasi alla superficie dei batteri. Questo dovrebbe essere fatto per ogni ceppo batterico destinato ad essere utilizzato nel saggio descritto. A questo scopo, i batteri lavati sono messi in contatto con 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml suina estratti di fegato esterasi (Sigma) in 1 ml di PBS per 1 ora a 37 ° C al buio. Solubile lattamasi 1 mg / ml (Invitrogen) possono essere usati come controllo positivo. Poi, una scansione delle emissioni è effettuato a eccitazione 405 nm utilizzando un PTI Quantamaster fluorimetro e un litro 1 mlz cuvetta. La perdita di FRET a 535 nm e la comparsa di un picco di 450 nm elevato sono visualizzati su di batteri oltre alla sonda CCF4.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Il saggio CCF4-AM/β-lactamase è un metodo semplice per rintracciare perturbazione vacuolare intracellulare indotto da Shigella flexneri e micobatteri in diversi tipi cellulari. Si fa uso di una lattamasi sensibili citoplasmatica FRET reporter che viene scisso da un enzima attivo sulla superficie dei batteri. Perdita del substrato CCF4-AM può essere facilmente evitato aggiungendo probenecid a tutte le soluzioni dopo il caricamento del substrato. Come dimostrato, il dosaggio può essere adattato a diversi tipi di cellule (cellule epiteliali, cellule fagocitarie) e formati (ben 96, 35 millimetri di vetro piatti peggiori, 6/12/24 piastre a pozzetti). Per l&#39;uso della piastra ben 6/12/24, coprioggetto sterili sono distribuiti sul fondo di ciascun pozzetto prima della semina delle cellule. Alla fine dell&#39;esperimento, coprioggetto vengono trasferiti su vetrini in mezzo di montaggio, come Prolong Oro Antifade Reagent (Invitrogen). Questo modo il segnale è stabile per periodi di tempo più lunghi dopo il dosaggiorispetto al formato a 96 pozzetti in cui i campioni sono conservati in PBS dopo la fissazione. L&#39;elevato costo del substrato CCF4-AM dovrebbe essere preso in considerazione prima di determinare il volume del campione. Questo è il motivo per cui si consiglia di scalare verso il basso. Gli esperimenti sono più costosi in formato ben 6/12/24 ma i segnali sono stabili per giorni. Al contrario, gli esperimenti sono più economici nel formato ben 96, ma i campioni devono essere analizzati il ​​giorno dell&#39;esperimento. È interessante notare che gli esperimenti dal vivo possono essere eseguite anche a 96 o formato ben 384. Questo permette di eseguire esperimento vivo utilizzando dozzine di condizioni contemporaneamente (batteri mutanti, MOI, trasfezione plasmide o siRNA, sostanze chimiche ecc) con numeri di posizioni per pozzetto. Anche adatto per Shigella flexneri, si evidenzia che &quot;vero&quot; tempo reale o esperimenti di time-lapse non sono fattibili per gli studi di micobatteri in quanto il ciclo di infezione supera concentrazioni misurabili di CCF4 che possono essere conservati nel citosol. PerPertanto, il substrato CCF4-AM è applicato su cellule solo dopo invasione è raggiunto. Nel caso in cui viene utilizzato il software MetaMorph per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi, si consiglia di utilizzare il modulo &quot;acquisizione schermo&quot; che permette l&#39;acquisizione di un intero 96/384 pozzetti con un determinato numero di immagini per bene. Inoltre, i dati di schermata del modulo &quot;recensione&quot; permette (i) visualizzando l&#39;immagine cucita mosaico di ogni pozzetto per qualsiasi canale contemporaneamente su un grande &quot;poster&quot; e (ii) il ciclo di un algoritmo specializzato per misurare le intensità nel 535 e i 450 canali nm. Anche se, siamo stati in grado di misurare la rottura vacuolare da batteri singoli usando la microscopia time-lapse, vorremmo mettere in guardia che l&#39;attività enzimatica sulla superficie dei singoli batteri varia rendendolo difficile da correlare con precisione il numero di batteri intracellulari e l&#39;efficacia delle vacuolare rottura. Data la robustezza del test, esso è adatto per hil throughput igh avvicina a 96 o 384 formati pure. Inoltre abbiamo adattato con successo questo protocollo per l&#39;analisi FACS per studiare l&#39;infezione di cellule in sospensione 16. Il saggio può essere utilizzato anche per la ricerca di altri batteri o di vettori lattamasi che presentano sulla loro superficie, portando ad una vasta gamma di applicazioni. Ad esempio, questo approccio può essere utilizzato per studiare rottura vacuolare indotta da altri agenti patogeni come β-lattamasi esprimendo Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes o Salmonella typhimurium 12. Dal momento che la Listeria monocytogenes è un breve ciclo di infezione paragonabili a Shigella flexneri, esperimenti di time-lapse sono possibili. Al contrario, perché Legionella pneumophila e Salmonella typhimurium cicli di infezione lunghi di visualizzazione, si consiglia di effettuare esperimenti di punto finale. La varietà di applicazioni possibili consente un dosaggio CCF4-AM/β-lactamaseinteressante metodo fluorimetrico per il monitoraggio rottura vacuolare indotta da patogeni intracellulari in campioni fissi o in tempo reale.

Numerosi agenti patogeni batterici sono internalizzati in compartimenti di membrana recintato di cellule eucariotiche durante il loro corso di infezione. Immissione di cella avviene tramite fagocitosi di cellule ospiti specializzate, come è il caso per Mycobacterium tuberculosis che vengono ingeriti dai macrofagi, o gli agenti patogeni inducono attivamente il loro assorbimento nelle cellule tipicamente non fagocitiche. Nel caso di assorbimento indotto, per esempio per Shigella flexneri, il patogeno inietta proteine ​​effettrici nel citosol host che dirottare tra le altre funzioni cellulari del macchinario smistamento endomembrane strettamente regolata conseguente localizzazione batterica all&#39;interno di un compartimento 1,2 endosomiale. Successivamente, Shigella sconvolge la membrana che racchiude porta alla rottura vacuolare e accesso citosolica del patogeno interferire con il traffico di membrana ospitante ed evitare la consegna al lisosoma. Più di recente, la rottura fagolisosomale è stata trovata anche come infezione strategy utilizzati dal Mycobacterium tuberculosis, un agente patogeno che è stato pensato per un lungo tempo per essere localizzati esclusivamente all&#39;interno di un compartimento di membrana 3,17. Per studiare la dinamica del traffico di membrana subcellulare di agenti patogeni invasivi, grandi miglioramenti sono stati compiuti dopo la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) studi alla fine del 1980 4,5 base. Per esempio, i metodi basati microscopia a fluorescenza con coloranti, anticorpi contro i componenti della superficie batterica, o marcatori per la co-localizzazione con compartimenti subcellulari ha assunto 6,7. Tuttavia, ancora non diano precise risoluzione spazio-temporale e la robustezza per misurare la rottura vacuolare da batteri patogeni quantitativamente. Questo ostacolo è stato affrontato con un metodo basato sul derivato CCF4-AM FRET giornalista cefalosporina che è stato prima utilizzato per studiare l&#39;espressione genica 8. Poi, è stato utilizzato nel contesto di infbiologia ezione di indagare secrezione effettrici e di seguire l&#39;assorbimento di Neisseria nelle cellule ospiti 9,10,11. Abbiamo sviluppato un saggio approfittando di questo reporter per lo studio di rottura vacuolare indotto da Shigella flexneri 12 e Mycobacterium tuberculosis 17. Il principio del nostro metodo è descritto in Figura 1 utilizzando Shigella flexneri. In primo luogo, le cellule ospiti vengono caricati con il FRET substrato CCF4-AM che viene intrappolato all&#39;interno del citoplasma dopo fendendo largo delle frazioni AM estere. Successivamente, le cellule sono infettate con Shigella flexneri. β-lattamasi presente sulla superficie dei batteri è in grado di scindere il substrato CCF4 appena si verifica la rottura vacuolare. Questo porta ad una perdita di FRET segnale di commutazione del picco di emissione da 535 nm a 450 nm su di eccitazione della sonda a 405 nm. La misura ratiometrica dei 450/535 nm intensità evidenzia integrità vacuolare: bassi rapporti riflettono membrana-enbatteri chiusi o extracellulare, mentre alti rapporti riflettono il contatto tra i batteri e il citosol host. Segnaliamo anche un adattamento di questo metodo per studiare la rottura phagosomal indotta da Mycobacterium tuberculosis in THP-1 macrofagi. I principi sperimentali rimangono gli stessi anche se la sequenza è invertita, CCF4-AM carico è applicato solo dopo infezione batterica. Così, da misure di fluorescenza raziometrici quantitativi a livello di singola cellula, la rottura vacuolare di Shigella flexneri possono essere monitorati in tempo reale e in campioni fissi da diversi tipi cellulari 12,13,14. Inoltre, questo metodo può essere adattato ad una serie di altri patogeni invasivi come mostrato in questo studio utilizzando Mycobacterium bovis e Mycobacterium tuberculosis. Infine, la miniaturizzazione del nostro protocollo a 96 bene (o 384 anche) formati consente lo screening di numerose condizioni a elevato throughput.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1089</td>
			<td>Protect from light, stock in - 80 &deg; aliquots</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Draq5</td>
			<td>Biostatus</td>
			<td>DR50050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&mu;CLEAR-PLATE, BLACK, 96 well </td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-lactamase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0389</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens

Shigella flexneri sono batteri patogeni che invadono le cellule ospiti che entrano in un vacuolo endocitico. Successivamente, la rottura di questo compartimento di membrana-incluso permette ai batteri di muoversi all&#39;interno del citoplasma, proliferare e invadere ulteriormente le cellule vicine. Mycobacterium tuberculosis viene fagocitato da cellule del sistema immunitario, ed è stato recentemente dimostrato che la rottura della membrana phagosomal nei macrofagi. Abbiamo sviluppato un test affidabile per il monitoraggio phagosomal interruzione della membrana dopo l&#39;entrata della cellula ospite di Shigella flexneri o Mycobacterium tuberculosis. L&#39;approccio fa uso di CCF4, un FRET giornalista sensibile alla β-lattamasi che equilibra nel citosol delle cellule ospiti. Upon invasione delle cellule ospiti da batteri patogeni, la sonda rimane intatto finché i batteri risiedono in compartimenti membrana chiusi. Dopo interruzione del vacuolo, l&#39;attività β-lattamasi sulla superficie dei patogeni intracellulari fende CCF4 istantaneamente portarerelativa ad una perdita di segnale FRET e della commutazione suo spettro di emissione. Questo robusto saggio raziometrica produce informazioni accurate sulla tempistica di rottura vacuolare indotta dai batteri invasori, e può essere accoppiata alla microscopia automatizzata ed elaborazione immagini con algoritmi specializzati per la rilevazione dei segnali di emissione FRET donatore e accettore. Inoltre, permette investigare le dinamiche di disgregazione vacuolare provocata da batteri intracellulari in tempo reale in cellule singole. Infine, è perfettamente adatto per l&#39;analisi ad alta produttività con una risoluzione spazio-temporale superiore a metodi precedenti. Qui, forniamo i dettagli sperimentali di protocolli di esemplari per il vacuolare saggio CCF4 rottura su cellule HeLa e THP-1 dai macrofagi per esperimenti di time-lapse o finali esperimenti usando Shigella flexneri e più ceppi di micobatteri come il Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, e Mycobacterium tuberculosis.

L&#39;approccio CCF4-AM/β-lactamase è un metodo robusto e sensibile per il monitoraggio rottura vacuolare di patogeni intracellulari come Shigella flexneri (Figura 1). I ceppi di Shigella che vengono utilizzati in questo studio sono definiti M90T Afai e BS176 Afai. M90T Afai è un ceppo Shigella flexneri che esprime la adesina AfaE, che è in grado di legare in modo efficiente CD55 sulla superficie delle cellule epiteliali 15. Ceppi che esprimono pertanto AfaE visualizzare capacità di invasione molto più elevate rispetto al ceppo M90T wild-type in cellule epiteliali. BS176 Afai è un AfaE esprimere mutante Shigella flexneri ceppo privo della virulenza Shigella plasmide. Questo ceppo è in grado di invadere le cellule HeLa. Tuttavia questo ceppo è in grado di entrare cellule THP-1 in quanto l&#39;assorbimento in questa linea cellulare conta soltanto su fagocitosi classica e non richiede un sistema di tipo-3 secrezione funzionale. Entrambi i ceppi esprimono β-lattamasiE visualizzazione dell&#39;attività β-lattamasi sulla loro superficie a causa della presenza del plasmide codificante AfaE. Al momento dell&#39;infezione cellule HeLa con la non-invasivo BS176 Afai ceppo per 1 ora, il CCF4 FRET sonda rimane intatto, come mostrato in Figura 2A dal segnale verde (535 nm). Al contrario, l&#39;infezione con il ceppo virulento M90T Afai per 1 ora porta ad un interruttore di segnale verso il blu (450 nm) evidenziando la scissione della sonda nel citosol. Per quantificare questo, abbiamo sviluppato uno script per il software Metamorph e Acapella che permette la rilevazione automatizzata delle celle e la misurazione delle intensità nei canali 535 e 450 nm per la determinazione del segnale raziometrico. Come mostrato nella Figura 2B, nuclei e citosol delle cellule sono segmentati utilizzando il canale DRAQ5. Quindi, l&#39;algoritmo è in grado di rilevare i 450 nm e le popolazioni di cellule positive nm 535 per calcolare i rapporti tra le due intensità per ogni singola cella che èrappresentate come un istogramma in Figura 2C. Bassi rapporti sono ottenuti per il ceppo mutante contro alti coefficienti del ceppo virulento. Anche se questo esperimento di infezione rappresentante è stata acquisita utilizzando la microscopia confocale, microscopia in epifluorescenza è adatto anche per questo compito figure 3 e 4 mostrano esempi utilizzando 2 diversi tipi di cellule umane:. HeLa cellule epiteliali e cellule THP-1 macrofago-come. Al momento dell&#39;infezione con il virulento M90T Afai Shigella ceppo per 1 ora e 90 min per HeLa e cellule THP-1, un interruttore di segnale da verde (535 nm) al blu (450 nm) viene osservato rispetto a BS176 Afai cellule infettate (Figure 3A e 4A). Lo script che abbiamo sviluppato sul software MetaMorph rileva direttamente la popolazione CCF4 positiva di cellule e calcolare il rapporto tra le intensità a 450 e 535 nm canali per ogni singolo celle. Poi le cellule sono classificate in funzione del loro rapporto utilizzando una macro sviped in Excel, ottenendo così istogrammi mostrano la distribuzione di celle. Come è stato il caso per l&#39;altro script sviluppato per Acapella, BS176 Afai cellule infettate sono caratterizzati da bassi rapporti, mentre M90T Afai cellule infette mostrano elevati indici utilizzando l&#39;algoritmo di MetaMorph sulle cellule HeLa e THP-1 nei macrofagi (figure 3B e 4B) . Infine, un adattamento di questo metodo per lo studio di micobatteri è mostrato in Figura 5. Mycobacterium bovis BCG risiede nel phagosome per tutto il corso dell&#39;esperimento, come riflesso dal forte segnale rilevato 535 nm per tutto il corso temporale dell&#39;esperimento. Al contrario, il Mycobacterium tuberculosis suscita phagosomal rottura della membrana in THP-1 macrofagi dopo più di 3 giorni di infezione, come evidenziato da un segnale di 450 Nm a 7 giorni di infezione (Figura 5A e 5B). Utilizzando lo stesso algoritmo per lo studio di rottura vacuolare da Shigella </em&gt;, abbiamo scoperto che Mycobacterium tuberculosis cellule infette mostrano alti 450/535 nm rapporti di Mycobacterium bovis BCG dopo 7 giorni di infezione (figure 5C e 5D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1.jpg" /> Figura 1. Schema rappresenta il principio del saggio CCF4-AM/β-lactamase per l&#39;inseguimento Shigella flexneri vacuolare rottura. CCF4-AM diffonde liberamente attraverso la membrana plasmatica nel citoplasma dove gruppi esterei vengono scisse fuori dalle esterasi citosoliche producono CCF4 anioni. Questa reazione impedisce CCF4 di entrare qualsiasi membrana vano incorporato. In questa fase, CCF4 suscita FRET a 535 nm su di eccitazione a 405 nm. La sonda rimane intatto fino a quando i batteri che esprimono β-lattamasi rupturE il vacuolo endocitico. In questa fase, il segnale FRET è perso perché CCF4 è tagliata da β-lattamasi innescando un interruttore a emissione da 535 nm a 450 nm su di eccitazione a 405 nm. <img alt="Figura 2" fo:content-width="2.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2.jpg" /> Figura 2. Monitoraggio Shigella flexneri vacuolare rottura usando la microscopia confocale. (A) Dopo 2 h 30 min di CCF4-AM carico, cellula HeLa sono infettati con il β-lattamasi che esprime Shigella flexneri BS176 Afai ceppo mutante o il Afai ceppo virulento M90T per 1 ora e fisso con paraformaldeide 4% per 10 min. Poi, i nuclei sono colorati con DRAQ5 e le cellule sono state riprodotte utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 10x. Immagini rappresentative sono stati scelti con i seguenti canali uniti: la sonda intatta CCF4 appare a 535 nm (green), la sonda spaccati CCF4 compare a 450 nm (blu). (B) Esempi di immagini evidenziando il sistema di rilevamento del nostro algoritmo automatizzato sul software Acapella. Segmentazione delle cellule (nuclei + citosol) è ottenuto utilizzando il canale DRAQ5. CCF4 cellule positive sono ottenuti utilizzando i canali 450 e 535 nm in pool insieme. (C) Istogramma che mostra il risultato della nostra analisi automatizzata su Acapella utilizzando Shigella flexneri BS176 Afai ceppo mutante o M90T Afai ceppo virulento. Il rapporto medio rappresenta il rapporto tra l&#39;intensità nei canali 450 e 535 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50116/50116fig2large.jpg" target="_blank">clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3.jpg" /> Figura 3. Monitoraggio Shigella flexneri vacuolar rottura in cellule HeLa mediante microscopia in epifluorescenza. (A) Dopo 2 h 30 min di CCF4-AM carico, le cellule HeLa sono infettati con il β-lattamasi che esprime Shigella flexneri BS176 Afai ceppo mutante o il Afai ceppo virulento M90T per 1 ora e fissato con paraformaldeide al 4% per 10 min. Poi, le cellule vengono esposte utilizzando un microscopio a epifluorescenza con un obiettivo 20x. Immagini rappresentative sono stati scelti con i seguenti canali:. CCF4 intatto sonda 535 nm (verde) e CCF4 spaccati sonda 450 nm (blu) (B) Istogramma che rappresenta il risultato della nostra analisi automatizzata del software MetaMorph. Le singole celle sono distribuiti in funzione del loro rapporto tra le intensità dei canali 450 e 535 nm. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4.jpg" /> &gt; Figura 4. Monitoraggio Shigella flexneri vacuolar rottura in cellule THP-1 usando la microscopia a epifluorescenza. (A) Dopo 2 h 30 min di CCF4-AM carico, cellule THP-1 sono infettati con il β-lattamasi che esprime Shigella flexneri BS176 Afai ceppo mutante o il M90T Afai ceppo virulento per 1 ora e 30 minuti e fissati con paraformaldeide 4% per 10 min. Poi, le cellule vengono esposte utilizzando un microscopio a epifluorescenza con un obiettivo 20x. Immagini rappresentative sono stati scelti con i seguenti canali:. CCF4 intatto sonda 535 nm (verde) e CCF4 spaccati sonda 450 nm (blu) (B) Istogramma che rappresenta il risultato della nostra analisi automatizzata utilizzando il software MetaMorph. Le singole celle sono distribuiti in funzione del loro rapporto tra le intensità dei canali 450 e 535 nm. ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Monitoraggio Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis rottura phagosomal in THP-1 macrofagi mediante microscopia in epifluorescenza. (A, B) cellule THP-1 sono infettati con β-lattamasi che esprime Mycobacterium bovis BCG o Mycobacterium tuberculosis per 2 ore e coltivate per 3 a 7 giorni . Dopo il lavaggio, le cellule sono caricati con CCF-4-AM per 2 ore e fissati con paraformaldeide al 4% per 30 minuti prima di imaging utilizzando un microscopio a epifluorescenza con un obiettivo 40x. Immagini rappresentative sono stati scelti con i seguenti canali: intatto sonda CCF4, 535 nm (verde); spaccati CCF4, sonda 450 nm (blu) (C, D) Gli istogrammi che presentano i risultati della nostra analisi automatizzata utilizzando il software MetaMorph.. Le singole celle sono distribuiti come funzione del rapporto tra l&#39;intensità nei canali 450 e 535 nm.

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Si descrive un metodo per l&#39;inseguimento della rottura endomembrane suscitato dai batteri intracellulari<em&gt; Shigella flexneri<em&gt;</em</em&gt; E<em<em&gt;<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt;</em</em&gt; Su di invasione della cellula ospite. La nostra analisi si avvale di CCF4, un host citoplasmatica sonda FRET in cellule vive o fisso. Questo reporter è degradata da una attività dell&#39;enzima presente sulla superficie batterica.

Misure singole cellule di Rottura Vacuolar causate da patogeni intracellulari

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Views.  Institut Pasteur, Paris, France. Si descrive un metodo per l'inseguimento della rottura endomembrane suscitato dai batteri intracellulari Shigella flexneri

Video: Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

Visualizzazione e quantificazione delle interazioni intracellulari di Neisseria meningitidis E umano α-actinina da Imaging confocale

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

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Immunologia e infezioni

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Scoperta di nuovi agenti patogeni intracellulari da amoebal co-coltura e approcci amoebal arricchimento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Applicazione di nanoparticelle fluorescenti per studiare rimodellamento del sistema Endo-lisosomiale da batteri intracellulari

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Trasformazione Biolistic di una fluorescente Tagged Gene nel Opportunistic Fungal patogeni<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em&gt; Salmonella</em&gt; In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...