Gli autori desiderano ringraziare Shelly Xie e Jennifer Payne per la loro assistenza tecnico esperto. Questo lavoro è stato reso possibile attraverso sovvenzioni da parte della Società di Urologia Pediatrica e lo Stanford Research Pediatric Fondo.

I. Preparazione dei cateteri uretrali <ol><li> Per ogni vescica del mouse e reni da campionare, posto 5-6 grani in acciaio inox (vescica, 1.6 mm o dimensione 0,9-2,0 miscela mm) o perle di ossido di zirconio (rene, 0,5 mm di diametro) in una provetta provetta Microbank ™, rispettivamente. Autoclave il tallone contenenti tubi. </li><li> Dopo i tubi raffreddare a temperatura ambiente, aggiungere 200 microlitri di PBS sterile ad ogni acciaio inox tallone contenenti tubi e 400 microlitri di PBS sterile ad ogni ossido di zirconio contenenti perline tubo. </li><li> Prepariamo cateteri uretrali come descritto da Hung e Hultgren 13. Autoclave una coppia pulita di testa piatta pinze e forbici fine (iride o altri tipi) e lasciare gli strumenti per raffreddare a temperatura ambiente. Pulire le superfici di una cappa a flusso laminare con il 70% di etanolo. Nel cofano, tagliare una (approssimativa) segmento 30 cm di tubo di polietilene. Asetticamente inserire un ago sterile da 30 gauge (1 / 2 pollice ago lungo) su una sterile siringa da 3 cc. Prendete una delle estremità del tubo in polietilene tagliato con le pinze in autoclave e far scorrere il tubo l&#39;ago fino ad incontrare il mozzo. Tagliare il tubo in modo che circa 2 cm si estende oltre la punta dell&#39;ago. Rimuovere il catetere dalla siringa e posto in una piastra di Petri sterile. </li><li> Per ridurre la probabilità di contaminazione incrociata, facciamo un catetere per ogni mouse. Dopo tutti i cateteri sono fatti, li sterilizzare in esposizione in un tegame scoperto petri ai raggi UV per almeno 30 minuti. Non guardare direttamente le lampade UV o esporre qualsiasi parte del corpo della cappa, mentre le lampade sono attivati. Dopo l&#39;esposizione ai raggi UV, cateteri possono essere conservati a lungo termine nella capsula di Petri. Si consiglia di sigillare il piatto con Parafilm per aiutare a mantenere la sterilità. </li></ol> II. Inoculazione degli animali <ol><li> I topi dovrebbero arrivare almeno una settimana prima di manipolazione sperimentale al fine di evitare fattori di confondimento indotta da stress. Topi di sesso femminile sono utilizzati per l&#39;uretra maschile del mouse è estremamente difficile da cateterizzare. CBA / J è un comunemente utilizzata, UTI sensibili ceppo di topi inbred. I topi devono essere utilizzati tra 8 e 12 settimane di età, poiché questa è la finestra di maturità immunologica prima della senescenza. Il primo giorno dell&#39;esperimento, immergere la fine di un ciclo sterile inoculare in una fiala di batteri congelati magazzino. Raschiare un inoculo piccolo e fuori vena su una piastra di agar adeguato. In generale, uropatogeni E. coli (UPEC) e altri ceppi possono essere coltivate pernottamento a Luria-Bertani (LB) agar a 37 ° C nell&#39;aria ambiente. Ceppi UPEC crescere come solido, colonie traslucido bianco-giallastro su agar LB. Restituire immediatamente il brodo batterica al congelatore. Ceppi uropatogeni batterica può diventare meno virulento nel tempo con ripetute, le culture di serie. Quindi, si consiglia di striature un piatto fresco agar per ogni esperimento. </li><li> Il giorno 2 di questo esperimento, dopo aver confermato la morfologia propria colonia, raccogliere singole colonie sulle piastre di agar e il luogo in almeno 5 cc di brodo di cultura durante la notte. LB brodo può essere utilizzato per i ceppi batterici più uropatogeni (37 ° C, 200 giri in aria ambiente). Tenere i tappi scioglierai sulla tubi cultura il brodo per permettere l&#39;aerazione. </li><li> Il giorno 3 di questo esperimento, prendere il 10% della cultura brodo di primo e cultura in brodo di nuovo durante la notte (di solito 37 ° C min e 200), per aumentare l&#39;espressione di tipo I pili. Culture brodo seriale aiutare ad ottimizzare uropathogenicity batterica, dal momento che pili di tipo I hanno dimostrato di essere un fattore critico per la virulenza uropatogeni in vivo 1. Tenere i tappi scioglierai sulla tubi cultura il brodo per permettere l&#39;aerazione. </li><li> Il giorno 4 dell&#39;esperimento, misurare il diametro esterno 600 del brodo di cultura fin dal primo giorno 3. Se non è già noto per il ceppo batterico in fase di test, eseguire dieci volte placcatura seriale diluizione nel corso di almeno 7 log (diluizioni effettuate con PBS, le culture eseguita su agar LB, 37 ° C notte di incubazione) per determinare il rapporto tra diametro esterno 600 e cfu / ml. Come regola generale, un OD 600 del 0,4-0,5 corrisponde in genere a 1-2x10 7 cfu per 50 microlitri. Una volta che il rapporto tra diametro esterno 600 e ufc / ml è stata determinata, si può regolare il brodo di cultura per l&#39;OD 600 cfu corrispondenti ai desiderata per il mouse in 50 microlitri di PBS. Alcuni lavori hanno suggerito che l&#39;inoculazione di 10 microlitri, piuttosto che 50, porta a meno reflusso nel kidneys6. Tuttavia, la maggior parte delle pubblicazioni hanno segnalato l&#39;uso di 50 microlitri per mouse. In generale, gli intervalli di cfu desiderata tra 10 6 e 108 ufc / mouse, ma ogni combinazione ceppo batterico / mouse deve essere empiricamente testato in vivo. </li><li> Per far sì che inoculi non siano annullate subito dopo l&#39;instillazione, topi dovrebbero essere privati ​​di acqua per almeno 30 minuti prima dell&#39;induzione dell&#39;anestesia generale. Un&#39;altra manovra chiave è quello di indurre la minzione prima dell&#39;induzione dell&#39;anestesia da scruffing topi e spingendo delicatamente la abdom inferioreit. Due al 2,5% isoflurano è una dose di induzione sicuro per 8-12 settimana di vita topi femmina CBA, seguita da mantenimento con anestesia 1,8-2% isoflurano. </li><li> Una volta che l&#39;anestesia è raggiunto, i topi sono posti in posizione supina con la testa inserita in un collegato alla nosecone isoflurano contenenti ossigeno. Basso addome viene massaggiato per evacuare l&#39;urina dalla vescica. Se la vescica è relativamente vuota, questa manovra non può produrre l&#39;urina. Basso addome e perineo è imbevuto di etanolo al 70%. </li><li> Una sterile 1 siringa senza ago cc viene usato per redigere l&#39;inoculo desiderato batterica. Poi, un catetere uretrale sterile è asettico posto sulla siringa. Il tubo in eccesso viene tagliato il catetere con un paio di forbici in modo che solo 1-2 millimetri di tubi rimangono distale rispetto alla punta dell&#39;ago. Poi, la siringa è sfruttato e lo stantuffo depresso con la siringa in posizione verticale per rimuovere tutte le bolle. Un ciuffo di lubrificante batteriostatico gelatina è schizzato su una piastra di Petri sterile o l&#39;interno della confezione di siringa sterile. La punta del catetere (con siringa allegato) è immerso nella gelatina. Se più ceppi batterici sono in fase di test nello stesso esperimento, fare attenzione a non utilizzare la stessa goccia di gelatina per lubrificare cateteri contenenti ceppi diversi. </li><li> Utilizzando un microscopio stereo (0,8 x per gamma di zoom 5x) per l&#39;ingrandimento, il cappuccio del clitoride anestetizzato del mouse viene delicatamente colto nella mano non dominante con un paio di pinze a denti fini e cresciuto cranialmente esporre il profondo meato uretrale rosa ( Figura 1). La siringa (con catetere allegato) è colto nella mano dominante con una presa matita e la punta del catetere è impegnata nel meato uretrale con un angolo di 45 gradi. Il cappuccio del clitoride è allungato lungo l&#39;asse della siringa, in modo efficace &quot;carico&quot; l&#39;uretra sul catetere. Questa manovra è fondamentale perché l&#39;uretra del mouse è ridondante. Il catetere deve scorrere facilmente in vescica (fino al mozzo, Figura 2), e può essere leggermente arricciati per navigare le pieghe ridondanti dell&#39;uretra. Una volta che il catetere è hubbed, la siringa può essere abbassato fino a quando non è parallelo con l&#39;asse longitudinale del mouse. La mano non dominante può scendere la pinza per contribuire a stabilizzare la posizione del catetere e la siringa come la mano dominante è usata per iniettare lentamente l&#39;inoculo (almeno 5 secondi). Se il liquido è visto che scorre intorno al catetere durante l&#39;iniezione, sia la vescica è piena o il catetere è nella vagina (appena caudalmente per l&#39;uretra). Iniezione deve essere immediatamente interrotto e la posizione del catetere attentamente esaminato. Se il catetere è stato nell&#39;uretra, il mouse dato non deve essere incluso nell&#39;esperimento. D&#39;altra parte, un catetere fuori luogo nella vagina può essere riposizionata e il tentativo di ri-iniezione. Dopo l&#39;iniezione, il catetere e la siringa è lentamente ritirato dal mouse. </li><li> Per ridurre la probabilità del primo post-inoculazione minzione, che possono evacuare batteri somministrati, e quindi portare a livelli di infezione variabile, alcuni ricercatori mantenere topi sotto anestesia per 30 minuti dopo transuretrale inoculation10. Dopo l&#39;intervento chirurgico, i topi dovrebbe recuperare su una coperta riscaldamento pulito, con osservazione continua a confermare ritorno della respirazione e attività normali. Una volta che gli animali hanno completamente recuperato la capacità di strisciare, possono essere restituiti a letto contenenti gabbie. </li></ol> III. CFU misura in tessuto infetto <ol><li> Varie pubblicazioni del mouse UTI hanno riferito sui risultati della cultura da 6 ore ad una settimana o più dopo l&#39;inoculazione. I punti di tempo ottimali devono essere determinati empiricamente per ogni combinazione ceppo batterico / mouse. Urine emesse si ottiene per la cultura da scruffing del mouse su una piastra di Petri sterile. Urine raccolte devono essere tenuti in ghiaccio in ogni momento. Più tentativi di ottenere l&#39;urina annullate molte ore può essere necessario, dato che lo svuotamento del mouse è frequente, a basso volume (30-100 microlitri per nulla), e lo stress-dipendente. </li><li> Dopo aver ottenuto i campioni di urina annullata, sacrifichiamo topo, utilizzando dislocazione isoflurano e cervicale. L&#39;addome è aperto in modo asettico. Se un campione di urina non è stata annullata con successo ottenuto in precedenza, una piccola quantità di urina può spesso essere aspirato attraverso la parete della vescica con un ago da 30 gauge e siringa. </li><li> Uno o entrambi i reni sono stati rimossi, tritati in almeno 4 pezzi (ogni pezzo deve essere inferiore a 50 microgrammi) su una piastra di Petri sterile, e messo in zirconio tallone / PBS contenenti cryovials sul ghiaccio. La vescica viene rimosso, tritati in almeno 4 pezzi, e messo in acciaio inox tallone / PBS contenenti cryovials sul ghiaccio. Il tessuto / perla / PBS contenenti cryovials sono posti in un proiettile omogeneizzatore Blender e dei tessuti vengono omogeneizzati utilizzando l&#39;impostazione &quot;8&quot; di velocità per un minuto. E &#39;comune per alcuni frammenti di tessuto a restarvi dopo omogeneizzazione. Finché 50-100 microlitri di omogenato liquido può essere pipettati, frammenti solidinon sono necessariamente un problema. Se il tempo di omogeneizzazione è aumentato per alcuni campioni, è importante farlo per tutti i tessuti al fine di mantenere la coerenza di omogeneizzazione. Utilizziamo un proiettile Blender omogeneizzatore perché evita la possibilità di contaminazione incrociata, è più rapida elaborazione singoli campioni uno dopo l&#39;altro utilizzando un omogeneizzatore standard, e non in modo significativo il calore dei campioni viene omogeneizzato. </li><li> Almeno due o tre dieci volte diluizioni di urina raccolte e omogenati di tessuto deve essere fatta in una micropiastra. Per gli esperimenti preliminari può essere prudente fare almeno sette dieci volte diluizioni. Cultura fino a 100 microlitri di urina, vescica e / o omogenati di rene su agar appropriato. Dal momento che i campioni di urina possono essere volume limitato, può essere necessario per portare i loro volumi da 100 microlitri prima di eseguire dieci volte diluizioni. Se questo è richiesto, la diluizione iniziale (prima diluizione decimale) dovrà essere preso in considerazione in calcoli finali dei rendimenti batterica. Noi preferiamo UPEC colture sulla eosina-blu di metilene o agar MacConkey (notte di incubazione a 37 ° C), dal momento che questi media sono selettivi per i batteri Gram-negativi. Ceppi UPEC crescono su agar MacConkey come centrale ombelicate, colonie grazie alla loro capacità di fermentare il lattosio rosso-rosa. </li><li> Dopo la cultura durante la notte, contare le CFU per ogni piatto. Per i campioni diluiti serialmente, la diluizione piatto contenente 50-100 colonie è considerato il conteggio più accurato. &quot;Indietro&quot; calcolare ufc per tessuto, per ogni milligrammo di tessuto, o per ml. </li></ol> IV. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Meato uretrale (scuro tessuto rosa) esposti sollevando cappuccio del clitoride cefalica con una pinza (al di là in alto nella foto) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Cateterizzati uretra. Il clitoride bifido può essere visto appena sopra il catetere. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Vescica cfu conta 2 giorni dopo l&#39;infezione transuretrale di 8 settimane di età femminile CBA / J topi con uropatogeni E. coli. Vesciche sono stati omogeneizzati e ufc / ml determinato dalla placcatura di diluizione in serie su agar MacConkey. Diamanti indicare ufc / ml per i singoli topi, barra orizzontale indica la mediana ufc / ml.

<ol>
	<li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice.">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li><li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract.">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li><li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder.">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li><li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending,+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin.">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li><li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli:+refining+the+murine+model.">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Induzione di infezioni del tratto urinario del mouse tramite l&#39;inoculazione di batteri transuretrale è una procedura ormai consolidata, ma tecnicamente impegnativo 11. Hung e Hultgren recentemente pubblicato un eccellente rassegna di tecniche transuretrale di infezione del tratto urinario del mouse 13. In questo lavoro, cerchiamo di illustrare ulteriormente i punti più fini di questo approccio sperimentale. I novizi possono praticare la loro tecnica eseguendo una ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>640201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps for cryovial tubes, with 'O' ring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>440011-N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bullet Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Next Advance</td>
<td>BBX24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zirconium Oxide Beads (0.5mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>ZROB05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Beads (1.6mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB14B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CBA/J Mice, 8-12 week old female</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories</td>
<td>000656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>1.10285.0500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>NDC 10019-773-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculating loops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-363-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eosin-methylene blue (EMB) agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Himedia Laboratories</td>
<td>MM022-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>427401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge needles, 1/2 inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>305106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml tuberculin Slip-Tip syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3 ml Luer-Lock syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309585</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transurethral induction of mouse urinary tract infection

Uropatogeni ceppi batterici di interesse vengono coltivate su agar. In generale, uropatogeni<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) e altri ceppi possono essere coltivate pernottamento a Luria-Bertani (LB) agar a 37 ° C nell&#39;aria ambiente. Ceppi UPEC crescere come colonie traslucido bianco-giallastro su agar LB. In seguito alla conferma della morfologia delle colonie del caso, singole colonie vengono poi raccolte per essere coltivate in brodo. LB brodo può essere utilizzato per i ceppi batterici più uropatogeni. Due porte seriali, pernottamento culture brodo LB può essere impiegato per migliorare l&#39;espressione di tipo I pili, un ben definito fattore di virulenza dei batteri uropatogeni. Culture brodo sono diluiti alla concentrazione desiderata in tampone fosfato (PBS). Da otto a 12 settimane i topi vecchi femminile sono posti sotto anestesia isoflurano e transurethrally inoculato con batteri utilizzando tubi di polietilene coperto di siringhe 30 gauge. Inoculi tipico, che deve essere empiricamente determinato per ogni combinazione ceppo batterico / mouse, sono 10<sup&gt; 6</sup&gt; A 10<sup&gt; 8</sup&gt; Ufc per mouse in 10-50 microlitri di PBS. Dopo il periodo di infezione desiderato (un giorno a diverse settimane), i campioni di urina e la vescica ed entrambi i reni vengono raccolte. Ogni organo è tritato, posto in PBS, e omogeneizzato in un omogeneizzatore proiettile blu. Omogenati di urina e di tessuto sono serialmente diluiti in PBS e coltivate su agar appropriato. Il giorno successivo, unità formanti colonie sono contate.

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Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Questo video dimostra metodi per indurre transurethrally infezioni del tratto urinario del mouse e quantificare l&#39;entità delle infezioni che ne derivano.

Induzione transuretrale di infezioni del tratto urinario mouse

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.4K Views.  Stanford University. Questo video dimostra metodi per indurre transurethrally infezioni del tratto urinario del mouse e quantificare l'entità delle infezioni che ne derivano.

Video: Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Preparazione di Immunogeno mouse ipofisari per l&#39;induzione di ipofisite autoimmune sperimentale

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

Infezione di apparato urinario in un modello animale piccolo: cateterizzazione transuretrale di topi maschi e femmine

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into the urinary bladder to either induce animal models of bladder pathologies or evaluate the effectiveness of intravesical treatments. Most rodent models of lower urinary tract (LUT) pathologies are induced in female mice due to ease of intravesical instillation of the substances via the female urethra. However, due to anatomical differences between the female and male LUT, transurethral instillation in a male mouse has been deemed a very challenging procedure, and it has not been previously described. In this manuscript, we provide a detailed description of how to prepare polyethylene (PE) tubing for subsequent insertion into the urethra of a male mouse. In addition, we discuss the ideal types of PE tubing to be used depending on the desired site of inoculation. Furthermore, we describe point by point how to prepare an animal for a successful transurethral instillation to avoid injury to the urethra and ensure the delivery of the solution to the desired location. The procedure is started by retracting the prepuce and the glans to expose the opening of the urethral meatus. Next, the glans are grasped by blunt non-crushing forceps to stabilize the penis and the PE tubing. The PE tubing is first inserted into the urethral meatus parallel to the animal body, then its angle is adjusted by tilting the catheter to maneuver it to follow the natural curvature of the urethra. This technique can be used to induced murine models of bladder pathologies and/or evaluate the effectiveness of intravesical treatments in male mice.

Transurethral instillation is a challenging procedure and has not been well described in the literature. The aim of this manuscript is to describe a technique for transurethral insertion of a catheter for intravesical delivery of liquids with active substances into the urinary bladder and/or prostate in adult male mice.

Procedura transuretrale instillazione in di topo maschio adulto

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Modelli murini di patologie gastriche e infezione da Helicobacter

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Isolamento di singole comunità batteriche intracellulari generati da un modello murino di infezione delle vie urinarie per analisi unicellulare a valle

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Induzione di lesioni polmonari del topo da Iniezione endotracheale di Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

In Vivo Augmentazione dell'induzione delle cellule T regolatorie Gut-Homing

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...