Questo protocollo può essere applicato con successo sia per indurre un'importante risposta infiammatoria e fibrotica in entrambi i polmoni mediante iniezione endotracheale di Bleomicina sia per convalidare nuove terapie sistemiche antinfiammatorie e anti-fibrotiche mediante infusione di vene di coda. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'iniezione diretta di Bleomicina nella trachea del topo garantisce un rapido targeting dei polmoni senza fuoriuscite nelle vie aeree superiori consentendo un'induzione sicura, robusta e riproducibile di infiammatori e fibrosi polmonari. A dimostrare la procedura sarà la Dott.ssa Fiorenza Orlando, medico veterinario del nostro laboratorio di collaborazione.
Per iniziare, posizionare il mouse anestetizzato sdraiato sulla schiena su una piattaforma chirurgica. Fissare delicatamente le gambe con strisce di nastro chirurgico per tenerlo in posizione. Per estendere iper estendere il collo del mouse, posizionare un supporto come il rotolo di cotone dentale sotto la sua regione cervicale.
Quindi usa una lama di rasoio per radere delicatamente la gola. Usa un paio di forcep anatomiche per pizzicare la pelle. Usa un paio di forbici smussate curve a maniglia ad anello per fare una breve incisione lunga circa mezzo centimetro in corrispondenza del muscolo sternoioideo del topo.
Usa bastoncini di cotone per fermare qualsiasi sanguinamento. Quindi esternalizza la trachea con dissezione smussata e puliscila delicatamente dal grasso e da altri tessuti. Ruotare la piattaforma chirurgica per orientare il mouse con la testa verso l'operatore che consente all'operatore durante l'iniezione di inclinare correttamente la siringa.
Per visualizzare la trachea, posizionare il mouse al microscopio operativo. Regolare l'illuminazione e impostare l'ingrandimento tra 1 e 1,2, quindi regolare la messa a fuoco e la nitidezza. La trachea può essere facilmente distinta come un tubo bianco traslucido con anelli tracheali chiaramente visibili.
Pipettare delicatamente per mescolare la soluzione di Bleomicina e aspirare 100 microlitri in una siringa da 0,5 millilitri con un ago calibro 25 evitando la formazione di bolle. Una volta che la trachea è chiaramente visualizzata, forarla con cura con la punta dell'ago con un angolo di 30 gradi. Iniettare lentamente 100 microlitri di Bleomicina direttamente nel lume della trachea.
Dopo aver aspettato alcuni secondi che l'intero volume percorre l'ago, rimuoverlo dalla trachea. Osservare alcuni secondi di apnea che si verificano quando l'ago viene inserito correttamente nella trachea indicando che l'intero volume di liquido è stato inalato. Scartare in modo sicuro la siringa e l'ago.
Chiudere la fascia sottocutanea e la ferita della pelle con una sutura assorbibile 5-0 e consentire all'animale di riprendersi. Dopo aver anestetizzato di nuovo il mouse e una volta confermata l'incoscienza, posizionare il mouse sotto un cappuccio sterile. Utilizzare una maschera facciale con un flusso continuo dell'1,5% di isoflurane per mantenere un'anestesia delicata durante l'esperimento.
Per promuovere la vasodilatazione e consentire un'iniezione più facile, immergere la coda in acqua tiepida per due minuti. Mescolare una sospensione delle cellule stromali mesenchimali del cordone ombelicale umano con pipettando delicatamente per evitare la formazione di ciuffi cellulari. Aspira 200 microlitri in una siringa da un millilitro con un ago calibro 26 evitando la formazione di bolle.
Tenere la coda vicino alla punta e raddrizzare delicatamente. Quindi individuare la vena laterale della coda. Raschiare delicatamente la coda con un bisturi e pulirla con il 70% di etanolo.
Partendo dalla porzione distale della coda, inserire l'ago nella vena con un angolo di 15 gradi. Infondere lentamente 200 microlitri di cellule stromali mesenchimali del cordone ombelicale umano. Per monitorare l'infusione endovenosa di successo, osservare il liquido entrare nella vena senza resistenza e mancanza di estravasazione.
Dopo aver aspettato alcuni secondi fino a quando l'intero volume viaggia lungo l'ago, rimuoverlo dalla vena. Quindi applicare brevemente la pressione sulla ferita d'ingresso con una garza sterile per prevenire il sanguinamento e consentire all'animale di riprendersi. Scartare in modo sicuro la siringa e l'ago dopo l'infusione.
Dopo l'iniezione di bleomicina, i cambiamenti istopatologici polmonari sono stati valutati da Epossilina ed Eosina e Picrosirius Colorazione Rossa confermando ampie infiltrazioni infiammatorie e fibrosi rispetto alla normale architettura polmonare dopo iniezione salina. L'infiammazione polmonare indotta dalla bleomicina e la fibrosi sono state in gran parte attenuate dall'infusione di cellule stromali mesenchimali del cordone ombelicale umano, ma non dalla soluzione salina. La deposizione di collagene è stata misurata mediante saggio idrossiprolina.
Dopo l'iniezione di bleomicina, i livelli di idrossiprolina sono progressivamente aumentati dall'ottavo al giorno 14 e 21. Mentre l'aggiunta di cellule stromali mesenchimali del cordone ombelicale umano ha ridotto significativamente gli effetti della bleomicina. I livelli di espressione del gene collagene Col1A1 di tipo uno nell'mRNA polmonare intero hanno anche mostrato un aumento progressivo ai giorni otto, 14 e 21 che è stato parzialmente ridotto dal trattamento cellulare stromale mesenchimale del cordone ombelicale umano.
L'immunostaining con anticorpi specifici ha mostrato che le cellule stromali mesenchimali del cordone ombelicale umano infuse hanno raggiunto rapidamente ed efficacemente i polmoni del topo, anche se sono state rilevate solo poche cellule. Questi dati suggeriscono una rapida lussazione delle cellule dalla lesione del sito nonostante l'effetto protettivo prolungato. L'uso di un microscopio operativo garantisce un'elevata fiducia di successo consentendo all'operatore di monitorare con precisione il corretto posizionamento dell'ago nella trachea del mouse prima dell'installazione, riducendo così al minimo il rischio di danneggiarlo.
