Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della gastroenterologia sull'impatto dei membri del microbiota, in particolare quelli del genere Helicobacter, sull'infiammazione e sul cancro. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio dell'infezione da Helicobacter e del suo impatto sullo stomaco in condizioni fisiologiche. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso lo sviluppo di terapie per la prevenzione o l'eliminazione dell'infezione da Helicobacter o delle sue conseguenze, inclusi antibiotici, farmaci o vaccini.
Questi metodi forniscono informazioni specifiche sulla patogenesi dell'infezione da Helicobacter. Tuttavia, molte delle tecniche possono essere adattate allo studio di altri agenti patogeni gastrointestinali. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà con la preparazione di un inoculo batterico in grado di stabilire un'infezione nei topi.
È imperativo che gli isolati helicobacter siano ceppi noti che colonizzano il topo e che non hanno subito un'ampia sottocultura in vitro. Inoltre, deve essere registrato il numero di sottoculture in vitro per questi ceppi. Aggiungere sospensioni batteriche a tubi in polistirolo da 15 millilitri e utilizzare un anello di plastica per trasferire una goccia da 10 a 20 microlitri da ogni coltura su singoli vetrini al microscopio.
Quindi, valutare la vitalità e la motilità dei batteri sotto microscopia a contrasto di fase con un ingrandimento 100 volte superiore. Utilizzare l'inocula H.pylori solo se la maggior parte dei batteri ha una forma bacillare. H.felis inocula dovrebbe contenere principalmente batteri a forma elicoiale.
E caricare l'inoculo in siringhe individuali, usa e getta, da un millilitro. Dotare ogni siringa di un ago calibro 23 e utilizzare pellicola di paraffina di plastica per attaccare un catetere monouso in polietilene a ciascun ago. Successivamente, trattenere manualmente un topo privo di agenti patogeni specifici di sei-otto settimane e privo di Helicobacter per il collo e la coda e inserire un catetere al centro della mascella aperta.
Guida il catetere in un caudale verso l'esofago, estendendo il collo del topo per consentire facilità di accesso allo stomaco attraverso l'esofago e lontano dalla trachea fino a quando la maggior parte o tutto il catetere non è più visibile e si sente una resistenza. Quindi, consegnare almeno uno per 10 al quinto batterio per garantire una colonizzazione ottimale e una patologia della malattia. Alla fine dell'esperimento, utilizzare forbici fini e curve per aprire la cavità addominale per l'escissione dello stomaco.
Tagliare lo stomaco lungo la curvatura maggiore e lavare delicatamente l'organo due volte in un tubo da 50 millilitri di PBS fresco per lavaggio per rimuovere eventuali alimenti residui. Dopo il secondo lavaggio, posizionare il tessuto in una piastra di Petri di plastica tarata di sei centimetri per registrare il peso umido. Dopo aver appiattito lo stomaco, bisect il campione sagittally in due frammenti di tessuto uguali che comprendono le regioni antrum, corpo e forestamach non ghiandolare.
Rimuovere la regione non ghiandolare e pesare la metà di ogni stomaco prima di conservare il pezzo di tessuto nella soluzione appropriata per l'analisi a valle pianificata. Aggiungere l'altra metà del tessuto dello stomaco a un tubo conico da 15 millilitri contenente il 10% di formalina, appiattindo i tessuti contro i lati superiore dei tubi dopo 10 secondi. Quando i tessuti sono stati apposti sulle pareti del tubo, immergere di nuovo i campioni nella formalina per almeno 24 ore.
Per contare il numero di H.pylori vitali nello stomaco dopo l'infezione, omogeneizzare i campioni di stomaco conservati in BHI ed eseguire diluizioni seriali duplicate degli omogeneati gastrici risultanti in brodo fresco e sterile. Dividere le piastre pre-essiccate di sangue di cavallo, o HBA, integrate con antibiotici aggiuntivi in tre o quattro segmenti e, utilizzando un adattamento della tecnica Miles e Misra, aggiungere da 10 a 100 microlitri di ogni diluizione omogenea dello stomaco su un segmento di ogni piastra di agar. Stendere gli omogenei con anelli di plastica sterili e lasciare asciugare le piastre.
Quindi, posizionare le piastre in posizione invertita in barattoli di gas anaerobe contenenti una piastra di petri d'acqua e una confezione di gas. Quindi, incubare i barattoli a 37 gradi Celsius per quattro o sette giorni. Quando le colonie possono essere osservate, enumerare i segmenti contenenti tra 10 e 100 colonie isolate.
Dopo l'eutanasia, lo stomaco viene raccolto dagli animali e pesato. La regione non ghiandolare viene rimossa e lo stomaco è diviso in due metà uguali che comprendono l'antro e il corpo. La colonizzazione riuscita è tipicamente confermata eseguendo un conteggio praticabile e una successiva enumerazione di singole colonie da omogeneati gastrici striate su piastre HBA.
Si noti che la presenza di batteri contaminanti dal microbiota gastrico del topo o da un gran numero di colonie di H.pylori può complicare l'enumerazione dei CFC H.pylori. In alternativa, la PCR può essere utilizzata per verificare l'infezione utilizzando primir convalidati specifici diretti a una regione di coppia a 325 basi dei geni H.felis e H.pylori ureB. In questo esperimento rappresentativo, i topi C57 Black-6 di tipo selvatico mostrarono segni moderati di infiammazione, tra cui iperplasia e atrofia della ghiandola a sei mesi dopo l'infezione da H.felis, così come l'infiltrazione cellulare della sottomucosa.
Infiammazione più grave si osserva nei topi knockout nello stesso momento, con l'ulteriore presenza di follicoli linfoidi osservati in prossimità degli infiltrati cellulari. I batteri H.felis possono anche essere visualizzati in sezioni macchiate di Giemsa del tessuto dello stomaco del topo infetto. Seguendo questa procedura, altri metodi come pcr quantitativo, immunoistochimica o immunofluorescenza possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sui tipi di risposte dell'ospite indotte durante l'infezione da Helicobacter.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia e della gastroenterologia per esplorare il ruolo causale dell'Helicobacter pylori nella malattia dello stomaco nell'uomo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare riproducibilmente i topi con le specie di Helicobacter e studiare la patologia associata all'infezione. Non dimenticare che i ceppi Helicobacter utilizzati in questo protocollo sono infettivi, e quindi le procedure standard di biosicurezza dovrebbero sempre essere seguite mentre si lavora con questi batteri.
