Gli autori non hanno alcun acknowledgement.

tutte le procedure con gli animali, tra cui il metodo e la durata dell'anestesia, come pure la cura postoperatoria, sono state discusse con un veterinario e approvate dalla istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) presso la istituzione affiliata. In questo manoscritto, tutte le procedure sono state eseguite con 8 a di topo maschio C57BL/6 di 15-settimana-vecchio e il protocollo segue le linee guida di cura degli animali approvate dal IACUC presso l'Università del Colorado.
 1. preparazione di tubi Nota: per infondere l'inoculo, un ago inserito per i tubi di polietilene (PE) ( Figura 1A) o un piccolo calibro (&#60; 24 G) angiocatheter può essere usato ( Figura 1). L'uso di un angiocatheter non richiede preparazione diverso da sterilizzazione con 70% di etanolo (EtOH). L'inoculo è la sostanza che è instillato/iniettato/depositato nell'apparato urinario. Può trattarsi di una soluzione contenente batteri, virus o una sostanza chimica. Questo è preparato prima del tempo e per il protocollo di ricerca. Ad esempio, se lo studio mira a valutare gli effetti di e. coli infezione del tratto urinario inferiore, il ricercatore dovrà preparare l'inoculo contenente batteri, che possono essere inoculati/instillato nel tratto urinario inferiore.
<ol><li>Preparazione dell'ago collegato al tubo di PE è semplice e consiste dei seguenti: scegliere la dimensione della tubazione PE sulla base dell'organo bersaglio e l'età di un animale. Per un animale di età inferiore a 12 settimane, utilizzare un tubo di PE-10 (diametro esterno è 0,024 pollici e diametro interno è 0,011 pollici). Tubi PE-10 sono suggerito per essere applicabile per (1) la semina primario dell'inoculo nella prostata anteriore (AP) e vescicole seminali (SV), o (2) la semina primario dell'inoculo nella vescica di un animale di età inferiore a 12 settimane di età. Tubi in PE con diametro maggiore di fino alla taglia 50 PE (diametro esterno fino a 0,038 pollici e diametro fino a 0,023 pollici interno) può essere utilizzato per la semina primario dell'inoculo nella vescica dei più vecchi animali.</li>
	<li>Tagliare circa 2,5 pollici di tubi PE.</li>
	<li>Selezionare un ago che misura il diametro di PE selezionato per essere utilizzato. Un ago da 27 G può andare bene nel lume del tubo PE-10, e un ago 22G si inserisce il lume del tubo PE-50.
	<ol><li>Preparare l'ago prima dell'inserimento nel tubo PE sfregando il bordo tagliente dell'ago su una pietra ad olio disponibile in commercio ( Figura 1A -B) per renderlo noioso, o utilizzare un blunt commercialmente disponibile f.</li>
	</ol></li> <li>Introdurre l'ago sordo ( Figura 1) nel lume del tubo PE. Evitare di danneggiare il lume o entrata in un lumen falso assicurando i resti dell'ago al centro del lume. ( Figura 1 -E). Se i tubi di PE sono danneggiato durante l'inserimento dell'ago sordo, tagliare l'estremità danneggiata e riavviare il processo.</li>
	<li>Inserire i tubi di PE ago inserito nel 70% di EtOH per sterilizzazione fino al suo utilizzo per la procedura. Flush il 70% EtOH attraverso il tubo dell'ago-PE per sterilizzare il lume e garantire non c' non è nessuna perdita dal tubo PE da danni durante il processo di inserimento dell'ago. Se c'è dispersione, scartato il tubo dell'ago-PE. 
	Nota: La punta del tubo PE deve essere liscia prima del cateterismo. Per evitare problemi con l'introduzione del tubo PE nell'uretra, si consiglia di tagliare la punta del tubo PE immediatamente prima del cateterismo ( Figura 1F). La lunghezza minima consigliata del tubo PE è 1,5 pollici, che comprende la parte che circonda l'ago.</li>
</ol> 2. Procedura di cateterizzazione <ol><li>prima dell'induzione dell'anestesia, svuotare la vescica di mouse.
	<ol><li>Applicare una leggera pressione e massaggio all'addome inferiore del mouse. Queste manovre in genere causare minzione spontanea. Una vescica piena può provocare la diluizione o la perdita immediata qualsiasi infuso inoculo. 
		Nota: Un'opzione aggiuntiva per garantire una vescica vuota in un mouse è di privare l'animale d'acqua per almeno 1 ora prima dell'inizio della procedura transuretrale instillazione. Privazione dell'acqua deve essere approvata dall'istituzione come parte del protocollo animali.</li>
	</ol></li> <li>Utilizzare una macchina di anestesia con isoflurano flusso (2%) per indurre anestesia.
	<ol><li>Una volta che l'animale è anestetizzato, posizionarlo su una coperta calda riscaldamento e coprirlo con un pad blu con il naso all'interno di una punta conica per il mantenimento dell'anestesia continua.</li>
		<li>Confermare che l'animale è in anestesia controllando il riflesso pedale (pizzico di punta).</li>
	</ol></li> <li>Una volta che il pedale riflesso è assente, procedere ritraendo il prepuce.
	<ol><li>Stampa la regione pubica con il pollice e il dito indice di una mano ( figure 2A e 2B) e tirare fuori il pene di ghiandole utilizzando il pollice e il dito indice di altra mano ( Figura 2). Quando questa operazione viene eseguita correttamente, il prepuzio, glande e il corpo del pene rimangono esposte. ( Figura 2D e Figura 2F). Non utilizzare pinze per tirare fuori il pene di ghiandole come questo si tradurrà in danni al tessuto.</li>
	</ol></li> <li>Lubrificare la punta del catetere e il glande con lubrificante chirurgico sterile prima dell'inserimento del catetere. Questo faciliterà l'inserimento della tubazione PE. 
	Nota: Singolarmente confezionati piazze di lubrificante chirurgico, invece di un condotto più largo, sono consigliate per ogni uso, per mantenere condizioni di sterilità.</li>
	<li>Premere delicatamente la punta del pene usando il forcipe noioso e spremere delicatamente il glande per causare il meato uretrale aprire.</li>
	<li>Tenere la siringa con l'ago inserito PE-tubazione o PE della tubazione stessa e inserire il tubo di PE tramite il meatus uretra. 
	Nota: Per stabilità, è consigliabile una presa treppiede della siringa con l'ago inserito PE-tubazione o il PE tubi se stessa utilizzando il pollice, indice e le barrette centrali. 
	Nota: Il percorso di cateterizzazione dovrebbe essere curvato dovuto alla naturale curvatura dell'uretra circondato dal pene di glans e il corpo del pene nel topo maschio adulto, come mostrato in Figura 3A e 3B di figura. I tubi di PE cateterizzato possono incontrare la resistenza durante la cateterizzazione, pertanto, si raccomanda di regolare l'angolo inclinando il tubo verso l'alto o verso il basso per aiuto anticipato i tubi di PE a seguito dell'organo bersaglio. Se necessario, i tubi di PE possono essere leggermente ruotato per aiutarlo manovra attraverso i vari tornanti dell'uretra. Quando c'è troppa resistenza, il tubo dovrebbe essere tirato indietro e quindi avanzare di nuovo con una pressione minima. Tirando il PE-tubo fuori completamente e usando maggiore lubrificazione può essere utile.</li>
	<li>Eseguire instillazione dell'inoculo, una volta che il PE-tubo ha raggiunto l'organo desiderato premendo lo stantuffo dell'ago per instillare il volume desiderato dell'inoculo (5-200 µ l di volume è suggerito).
	<ol><li>Per instillazione dell'inoculo nella vescica urinaria, avanzare la tubazione PE sino a circa 0,75 pollici di tubi di PE è inserita ( Figura 3A). 
		Nota: per instillazione dell'inoculo in AP e SV, generalmente, the inserita la tubazione incontra resistenza una volta che raggiunge il punto di apertura nella prostata anteriore. Regolando l'angolo inclinando il tubo verso l'alto o verso il basso, i tubi di PE avanzerà ulteriormente fino a circa 1 pollice di tubi di PE è stato inserito ( Figura 3B).</li>
	</ol></li></ol> 3. In Vivo Imaging del tratto urinario inferiore e reni Nota: lo scopo dell'imaging in vivo in questo manoscritto è: (1) per confermare la localizzazione spaziale dell'inoculo; e (2) per valutare l'incidenza del reflusso dell'inoculo per la reni. Per questo scopo, può essere utilizzato sia un mouse anestetizzato o euthanized.
<ol><li>Per visualizzare il tratto urinario inferiore di un topo maschio adulto, eseguire inferiore laparotomia mediana addominale per esporre la vescica, prostata e vescicole seminali.
	<ol><li>Incise la pelle nel midline dall'osso pubico appena sotto il processo xifoideo utilizzando forbici.</li>
		<li>Elevare la pelle di dosso il tessuto sottocutaneo.</li>
		<li>Identificare la linea avascolare alba situata nel midline ed incise per entrare nella cavità peritoneale, dove si trovano tutti gli organi.</li>
		<li>Confermare la localizzazione spaziale da visualizzazione del colorante blu o un altro agente di rilevamento adatto.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lee, S., Yang, G., Bushman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostatic+inflammation+induces+urinary+frequency+in+adult+mice.">Prostatic inflammation induces urinary frequency in adult mice.</a> PLoS One. 10 (2), e0116827 (2015).</li><li>Wong, L., Hutson, P. R., Bushman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostatic+inflammation+induces+fibrosis+in+a+mouse+model+of+chronic+bacterial+infection.">Prostatic inflammation induces fibrosis in a mouse model of chronic bacterial infection.</a> PLoS One. 9 (6), e100770 (2014).</li><li>Elkahwaji, J. E., Zhong, W., Hopkins, W. J., Bushman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+bacterial+infection+and+inflammation+incite+reactive+hyperplasia+in+a+mouse+model+of+chronic+prostatitis.">Chronic bacterial infection and inflammation incite reactive hyperplasia in a mouse model of chronic prostatitis.</a> Prostate. 67 (1), 14-21 (2007).</li><li>Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+inflammation+of+the+mouse+prostate.">Acute bacterial inflammation of the mouse prostate.</a> Prostate. 72 (3), 307-317 (2012).</li><li>Bjorling, D. E., Wang, Z. Y., Bushman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+inflammation+of+the+lower+urinary+tract.">Models of inflammation of the lower urinary tract.</a> Neurourol Urodyn. 30 (5), 673-682 (2011).</li><li>Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transurethral+induction+of+mouse+urinary+tract+infection.">Transurethral induction of mouse urinary tract infection.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Bjorling, D. E., Wang, Z. Y., Boldon, K., Bushman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cystitis+is+accompanied+by+increased+peripheral+thermal+sensitivity+in+mice.">Bacterial cystitis is accompanied by increased peripheral thermal sensitivity in mice.</a> J Urol. 179 (2), 759-763 (2008).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66 (6), 2798-2802 (1998).</li><li>Dinis, P., Charrua, A., Avelino, A., Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+resiniferatoxin+decreases+spinal+c-fos+expression+and+increases+bladder+volume+to+reflex+micturition+in+rats+with+chronic+inflamed+urinary+bladders.">Intravesical resiniferatoxin decreases spinal c-fos expression and increases bladder volume to reflex micturition in rats with chronic inflamed urinary bladders.</a> BJU Int. 94 (1), 153-157 (2004).</li><li>Cayan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+toxin+type+A+may+improve+bladder+function+in+a+rat+chemical+cystitis+model.">Botulinum toxin type A may improve bladder function in a rat chemical cystitis model.</a> Urol Res. 30 (6), 399-404 (2003).</li><li>Jerde, T. J., Bjorling, D. E., Steinberg, H., Warner, T., Saban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+mouse+bladder+inflammatory+response+to+E.+coli+lipopolysaccharide.">Determination of mouse bladder inflammatory response to E. coli lipopolysaccharide.</a> Urol Res. 28 (4), 269-273 (2000).</li><li>Saban, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-sensory+peptide+communication+in+experimental+cystitis.">LPS-sensory peptide communication in experimental cystitis.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 282 (2), F202-F210 (2002).</li><li>Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+invasion+augments+epithelial+cytokine+responses+to+Escherichia+coli+through+a+lipopolysaccharide-dependent+mechanism.">Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli through a lipopolysaccharide-dependent mechanism.</a> J Immunol. 166 (2), 1148-1155 (2001).</li><li>Saban, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminators+of+mouse+bladder+response+to+intravesical+Bacillus+Calmette-Guerin+(BCG).">Discriminators of mouse bladder response to intravesical Bacillus Calmette-Guerin (BCG).</a> BMC Immunol. 8, 6 (2007).</li><li>Bjorling, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+acrolein-induced+cystitis+in+mice.">Acute acrolein-induced cystitis in mice.</a> BJU Int. 99 (6), 1523-1529 (2007).</li><li>Sadler, K. E., Stratton, J. M., Kolber, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+bladder+distention+evoked+visceromotor+responses+as+a+model+for+bladder+pain+in+mice.">Urinary bladder distention evoked visceromotor responses as a model for bladder pain in mice.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo manoscritto descrive in dettaglio un metodo di transurethral instillazione in di topo maschio adulto. Differenziale zona primaria di semina è raggiungibile utilizzando PE tubi di diverso diametro. PE-50 è consigliato per raggiungere con successo il lume della vescica urinaria, mentre un più grande diametro che PE-10 viene utilizzato per raggiungere l'AP e SV (Figura 3A-B). Oltre alla scelta del formato della tubazione PE e organo bersaglio per inoculazione, altri f...

L'approccio di instillazione transuretrale è stato utilizzato negli studi precedenti come uno dei metodi per creare modelli del roditore di vescica patologie1,2,3,4 e può essere utilizzato per valutare la efficacia dei trattamenti localmente trasportati nei topi. Anche se i modelli animali non possono completamente ricapitolare patologie umane, identificazione dei meccanismi sottostanti negli studi sugli animali fornisce una migliore comprensione dei disordini LUT umani come la sindrome di dolore di cistite interstiziale, neurogena cistite, cistite autoimmune e infiammazione prostatica5.
La procedura transurethral instillazione effettuata su un topo maschio adulto è tecnicamente più complessa rispetto all'instillazione intravescicale in un topo adulto femmina6. L'anatomia naturalmente curva dell'uretra maschio insieme al suo piccolo diametro lo rendono tecnicamente difficile da realizzare l'inserzione di un catetere transuretrale. Di conseguenza, istruzioni dettagliate per l'induzione transuretrale di di infezione delle vie urinarie del mouse6 e LUT infiammazione7,8,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 via catetere della vescica-inserito precedentemente sono stati delineati per topi femmina solo. Questo manoscritto mira a fornire una descrizione dettagliata della tecnica per instillazione transuretrale di sostanze in di topo maschio, compreso la video clip, immagini e illustrazioni. Transuretrale instillazione procedure in un topo maschio adulto possono essere eseguite con variabile inoculates simile a quello precedentemente descritto in mouse femminile7 e si fuse con altre tecniche quali registrazioni di elettromiografia di visceromotor risposte (VMR)16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>63019-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>311411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>305129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle</td>
			<td>Instech</td>
			<td>LS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle</td>
			<td>Instech</td>
			<td>LS27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#34; Long x 2&#34; Wide x 1&#34; Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone</td>
			<td>Norton</td>
			<td>40204034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac</td>
			<td>Surgilube</td>
			<td>281020543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fluriso</td>
			<td>13985-528-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Curved</td>
			<td>vwr</td>
			<td>82027-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml Syringe</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8~12 weeks old male C57B/6 Mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transurethral instillation procedure in adult male mouse

Transuretrale instillazione può essere utilizzato per fornire diverse soluzioni con principi attivi (ad es., farmaci, sostanze chimiche, batteri e virus) localmente nella vescica urinaria a indurre modelli animali di patologie della vescica o valutare la efficacia dei trattamenti intravesical. Più modelli di roditori di inferiore del tratto urinario (LUT) patologie sono indotte nei topi femmina dovuta alla facilità di instillazione intravescicale delle sostanze tramite l'uretra femminile. Tuttavia, a causa di differenze anatomiche fra il LUT maschili e femminili, transurethral instillazione in un topo maschio è stato considerato una procedura molto impegnativa, e non è stata precedentemente descritta. In questo manoscritto, forniamo una descrizione dettagliata di come preparare i tubi di polietilene (PE) per il successivo inserimento nell'uretra di un topo maschio. In più, discutiamo i tipi ideali di tubi PE da utilizzare a seconda del sito di inoculazione desiderato. Inoltre, descriviamo punto per punto come preparare un animale per un successo instillazione transuretrale evitare lesioni all'uretra e garantire la consegna della soluzione nella posizione desiderata. La procedura viene avviata da ritrarre il prepuzio e il glande per esporre l'apertura del meato uretrale. Successivamente, il glande sono afferrati dal forcipe smussato non schiacciare per stabilizzare il pene e i tubi di PE. I tubi di PE prima viene inserito nel meato uretrale parallelo al corpo animale, quindi l'angolo è regolato inclinando il catetere per manovrare per seguire la naturale curvatura dell'uretra. Questa tecnica può essere utilizzata per indotti modelli murini di patologie della vescica e/o valutare l'efficacia dei trattamenti intravesical in di topo maschio.

Transuretrale instillazione di colorante blu tramite tubazione PE 50 provocato instillazione del colorante nella vescica urinaria (Figura 4A) e via PE 10 tubi in colorazione della SV e AP (Figura 4B), rispettivamente. Per valutare se l'instillazione transuretrale eseguito provoca un reflusso istantanea dell'inoculo ai reni o non, del rene e dell'uretere sono stati osservati seguita da instillazione di 100 µ l del colorante blu e...

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Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Instillazione transuretrale è una procedura difficile e non è stato ben descritto nella letteratura. Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere una tecnica per transuretrale inserzione di un catetere per consegna intravescicale di liquidi con sostanze attive nella vescica urinaria e/o della prostata nei topi del maschio adulto.

Procedura transuretrale instillazione in di topo maschio adulto

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into ...

transurethral-instillation-procedure-in-adult-male-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.4K Views.  University of Colorado School of Medicine. Instillazione transuretrale è una procedura difficile e non è stato ben descritto nella letteratura. Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere una tecnica per transuretrale inserzione di un catetere per consegna intravescicale di liquidi con sostanze attive nella vescica urinaria e/o della prostata nei topi del maschio adulto.

Video: Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on Luria-Bertani (LB) agar at 37&deg;C in ambient air. UPEC strains grow as yellowish-white translucent colonies on LB agar. Following confirmation of appropriate colony morphology, single colonies are then picked to be cultured in broth. LB broth can be used for most uropathogenic bacterial strains. Two serial, overnight LB broth cultures can be employed to enhance expression of type I pili, a well-defined virulence factor for uropathogenic bacteria. Broth cultures are diluted to the desired concentration in phosphate buffered saline (PBS). Eight to 12 week old female mice are placed under isoflurane anesthesia and transurethrally inoculated with bacteria using polyethylene tubing-covered 30 gauge syringes. Typical inocula, which must be empirically determined for each bacterial/mouse strain combination, are 106 to 108 cfu per mouse in 10 to 50 microliters of PBS. After the desired infection period (one day to several weeks), urine samples and the bladder and both kidneys are harvested. Each organ is minced, placed in PBS, and homogenized in a Blue Bullet homogenizer. Urine and tissue homogenates are serially diluted in PBS and cultured on appropriate agar. The following day, colony forming units are counted.

This video will demonstrate methods to transurethrally induce mouse urinary tract infections and quantify the extent of resulting infections.

Induzione transuretrale di infezioni del tratto urinario mouse

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Thymectomy completa in ratti adulti con non-invasiva intubazione endotracheale

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

Infezione di apparato urinario in un modello animale piccolo: cateterizzazione transuretrale di topi maschi e femmine

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the aquatic environment, where it interacts with a variety of higher aquatic species. Vertebrate fish are known to be an environmental host and are a potential V. cholerae reservoir in nature. Both V. cholerae and the teleost fish species Danio rerio, commonly known as zebrafish, originate from the Indian subcontinent, suggesting a long-standing interaction in aquatic environments. Zebrafish are an ideal model organism for studying many aspects of biology, including infectious diseases. Zebrafish can be easily and rapidly colonized by V. cholerae after exposure in water. Intestinal colonization by V. cholerae leads to the production of diarrhea and the excretion of replicated V. cholerae. These excreted bacteria can then go on to colonize new fish hosts. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae-intestinal colonization in zebrafish and how to quantify V. cholerae-induced zebrafish diarrhea. The colonization model should be useful to researchers who are studying whether genes of interest may be important for host colonization and/or for environmental survival. The quantification of zebrafish diarrhea should be useful to researchers studying any intestinal pathogen who are interested in exploring zebrafish as a model system.

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish are a natural Vibrio cholerae host and can be used to recapitulate and study the entire infectious cycle from colonization to transmission. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae colonization levels and quantify diarrhea in zebrafish.

Quantificare la colonizzazione di Vibrio cholerae e diarrea nel modello Zebrafish adulto

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic findings similar to human acute respiratory distress syndrome (ARDS). The resulting alveolar edema, alveolar-capillary barrier damage, and leukocyte infiltration predominantly affect the left lung, preserving the right lung as an uninjured control and allowing animals to survive. This model of self-limited acute lung injury enables investigation of tissue resolution mechanisms, such as macrophage efferocytosis of apoptotic neutrophils and restitution of alveolar-capillary barrier integrity. This model has helped identify important roles for resolution agonists, including specialized pro-resolving mediators (SPMs), providing a foundation for the development of new therapeutic approaches for patients with ARDS.

Selective intra-bronchial acid instillation to the left lung in mice results in unilateral and self-limited acute lung injury that models human acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by gastric acid aspiration.

Un modello di lesione polmonare acuta autolimitata dall'instillazione unilaterale dell'acido intra-bronchiale

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

Immunofluorescenza Colorazione utilizzando IBA1 e TMEM119 per densità microgliale, morfologia e infiltrazione delle cellule mieloidi periferiche nel cervello del mouse