Questo protocollo descrive una strategia terapeutica potenzialmente nuova che può essere prontamente modificata per applicazioni umane. Questa tecnica migliora direttamente l'induzione delle cellule T regolatorie intestinali nei tessuti linfoidi periferici e può essere implementata stabilmente anche in ambienti altamente pro-infiammatori. Queste tecniche possono anche essere utilizzate per studiare il ruolo della vitamina D attiva e della vitamina A all'interno del sistema immunitario periferico.
Questa dimostrazione visiva fornirà istruzioni dettagliate per la generazione di cellule dendritiche ingegnerizzate di alta qualità che sono fondamentali per il successo di questa tecnica. Inizia seminando una volta 10 alle sette cellule 293T in 20 millilitri di mezzo di coltura cellulare CM-10-D in piastre di coltura di 150 per 25 millimetri per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, aggiungere 1,62 millilitri di soluzione di HBS concentrata appena preparata, 9,5 microgrammi di plasmide dell'involucro, 17,5 microgrammi di plasmide da imballaggio e 27 microgrammi del plasmide LENTI-CYP-ALDH in un tubo conico da 50 millilitri.
Portare il volume finale del contenuto del tubo fino a 3,0375 millilitri con acqua seguito dall'aggiunta di 202,5 microlitri di due cloruri di calcio molare dropwise. Lasciare la miscela di precipitazione del DNA a temperatura ambiente per 20 minuti con miscelazione occasionale prima di aggiungere 3,24 millilitri della soluzione dropwise per coltura 293T mentre si ruota delicatamente il piatto. Posizionare le piastre nell'incubatrice per 24 ore prima di lavare delicatamente ogni piastra con PBS e nutrire le cellule con mezzo di coltura CM-4-D.
Dopo altre 24 ore di coltura, raccogliere i supernaganti in bottiglie sterili da immagazzinare a quattro-otto gradi Celsius e nutrire le cellule con mezzo CM-4-D fresco per altre 24 ore. Il quarto giorno, raccogliere nuovamente i supernatanti e filtrare i supernatanti da entrambi i giorni tre e quattro a un filtro da 0,45 micrometri. Quindi, concentrare il virus pseudotipato VSV-G per centrifugazione per 24 ore.
Il giorno dopo decantare i supernatanti. Lasciare scolare i tubi su un tovagliolo di carta in un armadio sterile di biosicurezza per diversi minuti, quindi risospendare i pellet in 33,3 microlitri di PBS sterile contenenti 5%glicerolo per piatto di coltura. Per la generazione di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo, posizionare le tibias e i femuri, raccolti da topi BALB/c, in un piatto di coltura da 100 per 20 millimetri contenente mezzo di coltura fresco.
Utilizzare forbici sezionanti e forcelle per rimuovere eventuali tessuti dalle ossa. Quando tutte le ossa sono state pulite, utilizzare le forbici per tagliare entrambe le estremità di ogni osso per esporre le cavità del midollo osseo. Utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 30 per sciacquare ogni osso con 10 millilitri di mezzo di coltura fresco, raccogliendo il midollo osseo in un tubo da 15 millilitri.
Una volta raccolto tutto il midollo osseo, sedimentare il midollo osseo mediante centrifugazione e rimescolare il pellet in due millilitri di tampone dilisi dei globuli rossi. Dopo quattro o cinque minuti a temperatura ambiente con scuotimenti occasionali, interrompere la reazione con 10 millilitri di terreno di coltura cellulare e raccogliere le cellule per centrifugazione. Resostigliere il pellet in 10 millilitri di mezzo di coltura CM-10-R per contare e regolare le cellule per uno per 10 alle sei cellule per millilitro di concentrazione media di coltura CM-10-R.
Aggiungere quindi alle cellule 100 unità per millilitro di GM-CSF murino ricombinante e 10 unità per millilitro di IL-4. Placcare quattro millilitri di cellule in singoli pozzi di una piastra di coltura di sei pozzi per la loro incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore. Alla fine dell'incubazione, aspirare delicatamente le cellule non aderenti.
Aggiungere il mezzo fresco integrato con GM-CSF e IL-4 alle colture prima di restituire le cellule all'incubatore di coltura cellulare per un'aggiunta di 48 ore. Alla fine della seconda incubazione, raccogliere le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo non aderenti in un tubo conico da 50 millilitri per la loro centrifugazione. Per generare cellule BMDC-CYP-ALDH, rimescolare le colture a una volta 10-6 cellule dendritiche per 500 microlitri di mezzo CM-10-R per concentrazione di pozzo e placcare 500 microlitri di cellule in ogni pozzo di una nuova piastra di coltura di sei pozzi.
Aggiungere 50 microlitri del virus LENTI-CYP-ALDH e 8 microgrammi per millilitro di protamina ad ogni pozzo, quindi posizionare la piastra nell'incubatrice per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire i supernaganti con un mezzo di coltura fresco e riportare le piastre all'incubatore di coltura cellulare per altre 24 ore. Alla fine della seconda incubazione, le cellule possono essere attivate con 100 nanogrammi per millilitro di lipopaccaride per pozzo per 24 ore prima del raccolto per analisi funzionali.
Rispetto alle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo parentale, le cellule BMDC-CYP-ALDH mostrano un'espressione migliorata di 1-alfa-idrossilasi. Le concentrazioni della forma attiva di vitamina D nei supernanti di coltura delle cellule BMDC-CYP e BMDC-CYP-ALDH sono circa 20 volte superiori a quelle osservate nelle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo parentale e nelle colture cellulari BMDC-ALDH. Le intensità fluorescenti media delle cellule BMDC-CYP-ALDH trattate con il substrato sono circa sei volte superiori a quelle delle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo parentale trattate con il substrato.
Ciò suggerisce che le cellule BMDC-CYP-ALDH esprimono un'attività enzimatica significativamente migliorata della deidrogenasi retinica-2. Le cellule DC2.4 trattate con vitamina D 25-idrossi e retina non inducono un cambiamento significativo nell'abbondanza di cellule T positive CCR9 positive CCR9 foxp3. Al contrario, le cellule DC2.4 CYP-ALDH trattate con vitamina D 25-idrossi e retina inducono un numero significativamente più elevato di cellule T regolatorie eviscere in modo dipendente dalla concentrazione.
Inoltre, rispetto alle cellule di controllo iniettate per via intraperitoneale, le cellule DC CYP-ALDH inducono anche un aumento significativo del numero di cellule T positive CD4 positive CCR9 foxp3 dopo iniezione intraperitoneale negli animali ricevente BALB/c. Il successo della procedura dipende dalla preparazione di cellule T sane e da una miscela di DNA correttamente preparata.
