Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione DP2OD008470 NIH. Inoltre, la RAM è stato sostenuto in parte da fondi messi a disposizione dalla University of Notre Dame Graduate School. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche, il Centro per la ricerca Zebrafish, e il Centro per le cellule staminali e la medicina rigenerativa presso l&#39;Università di Notre Dame. Ringraziamo in modo particolare i membri del laboratorio per impegnarsi discussioni circa la biologia di rene e il loro utile feedback su questo lavoro.

Le procedure per lavorare con embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l&#39;Università di Notre Dame. 1. preparazione di soluzioni <ol><li> Fare una soluzione 50x magazzino di E3 mezzi dell&#39;embrione mescolando 73,0 g di NaCl, 3,15 g KCl, 9.15 g CaCl 2, e 9,95 g MgSO 4 a 5 L di acqua distillata, e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Per la coltura di embrioni di zebrafish, diluire la soluzione 50x magazzino di E3 mezzi embrione stock ad una soluzione di lavoro 1x con acqua distillata, quindi aggiungere 200 ml di 0,05% blu di metilene per ogni 1 L di 1x E3 di agire come fungicida, e conservare a RT. </li><li> Fare una soluzione pigmentazione blocco di E3 mezzi embrione con 0,003% 1-fenil-2-tiourea (PTU) mediante la combinazione di 40 ml di 50x E3 azione con 0,06 mg PTU. Quindi portare il volume a un totale di 2 L con acqua distillata. </li><li> Mescolare la O E3 / PTU / N a temperatura ambiente per ottenere la polvere PTU in soluzione. Poi memorizzare l&#39;E3 / PTU aRT. Nota: L&#39;E3 / PTU ha una durata di circa una settimana, e le soluzioni più anziani saranno meno efficace nel bloccare lo sviluppo pigmentazione nelle larve zebrafish. </li><li> Effettuare una soluzione anestetica del 0,2% Tricaine (MS-222) aggiungendo 1 g di Tricaine a 500 ml di acqua distillata e regolare il pH a 7,2 con 1 M Tris, pH 9,5. </li><li> Preparare per ottenere una soluzione di metilcellulosa 2% per l&#39;imaging ponendo una soluzione di 1x E3 (senza blu di metilene), con 1/10 volume di 0,2% Tricaine aggiunto a 4 ° C. Nota: La soluzione metilcellulosa è una soluzione di spessore, chiaro che viene utilizzato per stabilizzare delicatamente embrioni vivi per la microscopia. Dopo l&#39;esecuzione manipolazioni gli embrioni possono essere lavati in 1x E3 di sciogliere la metilcellulosa senza ferire l&#39;animale e consentendo la microscopia in fasi successive nello stesso campione. </li><li> Quando raffreddato a 4 ° C, mescolare la soluzione 1x E3 / Tricaine energicamente su un piatto mescolare e aggiungere gradualmente la giusta quantità di metilepolvere di cellulosa, pur continuando a mescolare energicamente. Aggiungere gradualmente la polvere alla soluzione per evitare la formazione di aggregati insolubili metilcellulosa. </li><li> Dopo tutta la polvere viene miscelato nella soluzione di metilcellulosa / E3 / tricaine 2%, mescolare la soluzione composita in C stanza fredda 4 ° O / N. Nota: La temperatura fredda è migliore per sciogliere completamente la polvere. Se la soluzione non è chiara dopo una notte, agitare per una giornata lavorativa supplementare e / o un secondo O / N. </li><li> Per rimuovere le bolle d&#39;aria dalla soluzione / tricaine E3 2% metilcellulosa /, un&#39;aliquota il composto in provette da 1,5 ml e girano ad alta velocità (12.000 xg) a 4 ° C per 30 minuti o fino a 2 ore. </li><li> Mettere la soluzione / E3 / Tricaine metilcellulosa 2% a 4 ° C per una conservazione a lungo termine. Nota: Prima di utilizzo, le aliquote devono essere pre-riscaldato a temperatura ambiente per lavorare con i campioni di zebrafish. </li></ol> 2. Preparazione di strumenti <ol><li> Preparare uno strumento embrione manipolatore, utilizzato per Podi posizionamento a embrioni per la microiniezione, allegando una punta di caricamento del gel sulla punta di un ago da dissezione dritto 5 &quot;, e fissare con nastro adesivo o colla. </li><li> Preparare aghi microiniezione con un estrattore ago, dalla prima immissione un fuoco lucido 10 centimetri in vetro borosilicato con filamento nello strumento e fissare il vetro borosilicato stringendo le maniglie. </li><li> Tirare il vetro borosilicato alla moda aghi fine-conici. Utilizzare le seguenti impostazioni: riscaldare 540, tirare 245, velocità 200, e il tempo 125. </li><li> Luogo aghi all&#39;interno di una capsula di Petri, li sospensione su una striscia di plastilina per proteggere le punte degli aghi, e mantenere il piatto coperto per evitare l&#39;accumulo di polvere. </li><li> Per finire di preparare l&#39;ago per microiniezioni, utilizzare un bordo lama di rasoio o pinza sottile per tagliare l&#39;estremità tirato dell&#39;ago per creare una punta tagliente iniezione angolare con un diametro di circa 0,05-0,1 mm. </li><li> Per rendere il vassoio microiniezione, preparare un 1,5% di agarosio soluzione / E3 in un 100 ml beuta e sciogliere l&#39;agarosio riscaldando il E3 a ebollizione in una microonda indi si lascia raffreddare a temperatura ambiente per circa 10 min. </li><li> Versare la soluzione di agarosio / E3 raffreddato in una capsula Petri di fare una fondazione con una profondità di circa 0,5 CM. Quando questo è solidificato versare un secondo strato con una profondità di circa 0,3 cm ed inserire lo stampo embrione ben prefabbricati e consentire l&#39;agarosio solidificare a temperatura ambiente. Nota: Quando si inserisce lo stampo nello strato / E3 superiore agar, ponendo lo stampo in agar con un angolo di diminuire il numero di bolle d&#39;aria. </li><li> Quando l&#39;intero vassoio microiniezione ha fissato, sollevare l&#39;embrione prefabbricata ben modellare lentamente e accuratamente con un scoopula, quindi riempire il piatto con la soluzione E3 e conservare a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparazione Embrione <ol><li> Impostare serbatoi accoppiamento zebrafish inserendo divisori nelle camere di accoppiamento e riempire con acqua del sistema. </li><li> Posizionare un pesce su ciascun lato del divisore such che ciascuna camera di accoppiamento contiene una femmina e uno di pesce di sesso maschile, e coprire ciascuna camera di accoppiamento. </li><li> La mattina seguente, togliere i divisori per consentire la deposizione delle uova. </li><li> Controllare il pesce dopo circa 30 minuti, e dopo il ritorno gli adulti per l&#39;acquario, raccogliere i loro embrioni facendo passare l&#39;acqua della vasca di accoppiamento attraverso una multa strumento colino rete metallica. </li><li> Invertire il filtro su una capsula di Petri e risciacquare con E3 per raccogliere gli embrioni. </li><li> Incubare gli embrioni a 28,5 ° CO / N. </li><li> Quando embrioni hanno raggiunto la fase 24-26 somite 26, decantare maggior parte dei media E3 e poi dechorionate aggiungendo 100 ml di 50 mg / ml pronase per ogni piatto di embrioni e incubando il piatto a RT (23 ° C) per circa 15 min. Nota: Ci vorranno circa 24-25 ore dal momento della fecondazione per gli embrioni di raggiungere la fase 24-26 somite se sono raccolti nel modo descritto e incubata O / N a 28,5 ° C. </li><li> Riempire il piatto conE3 e poi miscelare delicatamente per rimuovere i chorions dagli embrioni. </li><li> Decantare il E3 / pronasi e sciacquare il piatto con 25 ml di E3 fresco. passo risciacquo Ripetere per rimuovere tutti Pronasi. </li><li> Per bloccare lo sviluppo di pigmentazione, decantare il E3 e sostituire con 25 ml di fresco E3 / PTU quando gli embrioni hanno raggiunto 24 ore dopo la fecondazione. Nota: Per gli esperimenti che abbracciano diversi giorni, sostituire la soluzione E3 / PTU con mezzi freschi una volta al giorno per mantenere il piatto pulito. </li></ol> 4. la microiniezione di soluzione nefrotossina <ol><li> Il giorno dell&#39;iniezione, preparare la soluzione nefrotossina desiderata con il controllo del veicolo appropriato. </li><li> Vortex o mescolare gentilmente per garantire il farmaco (s) è / sono in soluzione, controllando i lati del tubo e superiore della colonna d&#39;acqua. Nota: Le soluzioni nefrotossina possono essere preparati per contenere tracce di fluorescente destrano coniugato a monitorare l&#39;efficienza microiniezione e anche valutare la clearance renale a Collpunti di tempo confluente 20,28. </li><li> Caricare un ago microiniezione rifinito con ~ 2-3 ml di nefrotossina infilando una punta fine caricamento del gel nella parte posteriore dell&#39;ago e di sospendere l&#39;ago verticalmente con un pezzo di nastro per consentire la soluzione per riempire la punta dell&#39;ago rifilato dalla forza di gravità. </li><li> Una volta che la punta dell&#39;ago è pieno, garantire l&#39;ago caricato nel micromanipolatore. </li><li> Testare il volume microiniezione mettendo una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e iniettare nell&#39;olio per valutare la dimensione delle gocce. Un volume di iniezione di 500 pl ha un diametro di 0,1 mm. </li><li> Rimuovere il piatto di embrioni dal termostato, e anestetizzare con l&#39;aggiunta di circa 5 ml di 0,2% Tricaine al piatto dell&#39;embrione. </li><li> Per garantire la completa anestesia, toccare delicatamente embrione con la punta dello strumento dell&#39;embrione manipolatore. La mancanza di movimento indica anestesia sufficiente. </li><li> Dopo anestesia successo, il trasferimento di embrioni allo stampo di iniezione con un trasfER pipetta. </li><li> Manovri ogni embrione in una diversa e dello stampo mettendo la testa nella zona più profonda del pozzo in modo che il tronco appoggia lungo la depressione e la coda sporge dalla depressione. </li><li> Inserire l&#39;ago riempito in micromanipolatore e posizionare la punta dell&#39;ago accanto ad un embrione. </li><li> inserire delicatamente l&#39;ago nel vaso coda spostando il joystick in avanti e premere il pedale del piede per fornire la microiniezione. Nota: iniezione di successo può essere desunta dal guardando il liquido entrare circolazione. Inoltre, co-iniezione della nephrotoxicant con fluorescente destrano coniugato consente al ricercatore di verificare iniezione di successo successivamente alla procedura. </li><li> Delicatamente tirare indietro il joystick per rimuovere l&#39;ago dall&#39;embrione. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, trasferire gli embrioni per un piatto pulito e risciacquare per rimuovere il Tricaine e sostituirlo con fresco E3 / PTU. </li><li> Incubare l&#39;embrione fino al punto desiderato tempo di asinis morfologia, che può essere documentata dalla fotografia in metilcellulosa mezzo di montaggio, o di un processo per l&#39;analisi sperimentale, se lo desideri. Nota: Il recupero di embrioni deve essere valutato per determinare la percentuale di individui con edema, che indica comunemente danno renale. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un svariato numero di agenti terapeutici sono stati associati con AKI 29. Ci sono stati notevoli progressi della ricerca nella comprensione del danno indotto da molti composti individuali, come la gentamicina aminoglicosidi 30 e il cisplatino chemioterapico ampiamente usato 31,32. Alcuni cambiamenti patologici coinvolti in queste condizioni, tuttavia, rimangono oggetto di studio in corso. Una sfida emergente rimane la comprensione di come più farmaci influenzano negativamente i pazienti...

Aki è una perdita improvvisa della funzione renale che può portare a conseguenze per la salute devastanti 1. AKI è un problema sanitario rilevante in tutto il mondo a causa della sua elevata incidenza di circa il 20% tra i pazienti ospedalizzati, con tassi ancora più elevati di 30-50% nei casi di terapia intensiva e gli anziani, e il tasso di mortalità del 50-70% 1-3. Purtroppo, la prevalenza di AKI è in aumento e si prevede a crescere ulteriormente nel prossimo decennio, in parte a causa della diversità dei fattori che possono indurre AKI, che includono stress post-operatorio, ischemia, e l&#39;esposizione a nefrotossine come antibiotici e farmaci chemioterapici 4. AKI comporta danni cellulari improvvisa all&#39;interno del rene, che si verificano comunemente in nefroni, che sono le unità funzionali essenziali, e sono composti da un filtro del sangue e un tubulo segmentato che drena l&#39;urina in collettori centrali 1. Quando un numero significativo di nefroni sonodanneggiato durante AKI, gli effetti immediati di una interruzione della clearance rifiuti dalla circolazione, e il flusso del fluido ridotta o abolita attraverso nefroni a causa di ostruzione da cellule morte e morenti 1. Nel corso del tempo, l&#39;ostruzione tubolare può portare alla degenerazione di intere nefroni, che riduce in modo permanente la funzione renale 1. Alterazioni fisiologiche nel rene seguenti AKI coinvolgono anche eventi infiammatori complessi che possono portare a cicatrici cronica 1. Nonostante questi risultati, nefroni hanno una certa capacità di subire rigenerazione dopo AKI che ricostituisce il 5,6 tubolare dell&#39;epitelio. Mentre vi è stata una comprensione molecolare crescente di rigenerazione nefrone, i meccanismi rimangono sfuggente in molti aspetti e impongono prosecuzione degli accertamenti 7. La misura in cui AKI si traduce in un danno renale permanente rimane sconosciuta. La ricerca attuale suggerisce il potenziale rigenerativo per il rene è lapiù alto dopo meno gravi casi di AKI, mentre gli episodi più pronunciati o ripetute portano alla malattia renale cronica (CKD) e culminano nella malattia renale allo stadio terminale (ESRD) che richiede il trapianto salva-vita o la dialisi 8,9. Inoltre, gli individui già affetti da insufficienza renale cronica sono ad un ancora più elevato rischio di contrarre una grave episodio di AKI 8,9. Nel loro insieme, è chiaro che ha continuato la ricerca di base e clinica è fondamentale per comprendere, trattare e prevenire AKI. La ricerca con modelli animali è stato determinante per apprezzare la progressione delle alterazioni locali e ambientali che si verificano durante AKI 10. Per espandere questa comprensione e sviluppare nuove terapie, il modello animale zebrafish è stato impiegato in una varietà di modi 11,12. I nefroni del rene zebrafish, sia l&#39;embrione e adulti, mostrano un alto grado di conservazione con i mammiferi 13-16. Inoltre, lesioni epiteliali nefrone in zebrafish assomiglia al processo di vertebrati superiori, per cui la distruzione locale del cellule tubulari è seguita da proliferazione intratubulare e ristabilimento di architettura nefrone 17-19. Nell&#39;embrione, però, ingenti danni tubulo dalle nefrotossine come cisplatino è associata a letalità 20,21. In confronto, gli adulti zebrafish sopravvivono AKI e mostrano capacità rigenerative sostanziali nel rene. Ad esempio, dopo l&#39;esposizione al gentamicina antibiotici aminoglicosidi, zebrafish rigenerare tubulo danno epiteliale e far crescere nuove unità nefrone così 22-24. Mentre questi studi AKI gentamicina indotta hanno fornito preziose informazioni, la comprensione danno renale da diversi nefrotossine rimane fondamentale per apprezzare gli effetti e la risposta a diversi tipi di danni 25. L&#39;embrione zebrafish, a causa della sua dimensione, trasparenza, e trattabilità genetica, ha molti vantaggi per gli studi nefrotossina &lt;sup&gt; 25, in cui il metodo di microiniezione 20,21 viene utilizzato per gestire la molecola (s) per indagini. Nefroni sono formate da 24 ore dopo la fecondazione (HPF) e cominciano a filtrare il sangue di circa il 48 HPF 26,27. Così, la rapida formazione e la funzione del rene embrionale facilita analisi sperimentale. Tuttavia, il processo di microiniezione ha sfide tecniche e non ci può essere una ripida curva di apprendimento per padroneggiare la tecnica. In questo articolo il video, si descrive come eseguire microiniezioni e fornire suggerimenti sulla risoluzione dei problemi al fine di migliorare il tasso di iniezioni di successo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:129px;">AB01915</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;(microinjection tray) 150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micrometer</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>2280-24</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

I reni sono suscettibili di nuocere dall&#39;esposizione a sostanze chimiche che filtrano dal flusso sanguigno. Questo può portare a lesioni d&#39;organo associata ad un rapido declino della funzione renale e lo sviluppo della sindrome clinica nota come danno renale acuto (AKI). agenti farmacologici usati per trattare le circostanze mediche che vanno da un&#39;infezione batterica al cancro, quando somministrato singolarmente o in combinazione con altri farmaci, possono avviare AKI. Zebrafish sono un modello animale utile per studiare gli effetti chimici sulla funzione renale in vivo, in quanto costituiscono un rene embrionale composto di unità funzionali nefrone che sono conservati con vertebrati superiori, compreso l&#39;uomo. Inoltre, zebrafish può essere utilizzata per eseguire schermi genetici e chimici, che offrono opportunità per chiarire gli aspetti cellulari e molecolari di AKI e sviluppare strategie terapeutiche, come l&#39;identificazione di molecole nefroprotettivo. Qui, dimostriamo come microiniezione nelzebrafish può essere utilizzato come un paradigma per gli studi nefrotossina.

Una stazione di microiniezione istituito comprende uno stereomicroscopio, micromanipolatore e regolatore di pressione (Figura 1A). Transilluminazione della piastra iniezione è preferibile visualizzare campioni durante questa procedura (Figura 1B). Preparazione dell&#39;ago iniezione coinvolge tirando il vetro borosilicato appropriata, seguita preparando il bordo con taglio e back-caricare l&#39;ago fine. In modo ottimale, la punta dell&#39;ago è smussa...

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Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Views.  University of Notre Dame.  lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi. 

Video: Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Ricerca

Biologia

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Attivazione di apoptosi da Microiniezione citoplasmatici del Citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish adulti

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...