Name: nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione DP2OD008470 NIH. Inoltre, la RAM è stato sostenuto in parte da fondi messi a disposizione dalla University of Notre Dame Graduate School. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche, il Centro per la ricerca Zebrafish, e il Centro per le cellule staminali e la medicina rigenerativa presso l&#39;Università di Notre Dame. Ringraziamo in modo particolare i membri del laboratorio per impegnarsi discussioni circa la biologia di rene e il loro utile feedback su questo lavoro.

Le procedure per lavorare con embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l&#39;Università di Notre Dame. 1. preparazione di soluzioni <ol><li> Fare una soluzione 50x magazzino di E3 mezzi dell&#39;embrione mescolando 73,0 g di NaCl, 3,15 g KCl, 9.15 g CaCl 2, e 9,95 g MgSO 4 a 5 L di acqua distillata, e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Per la coltura di embrioni di zebrafish, diluire la soluzione 50x magazzino di E3 mezzi embrione stock ad una soluzione di lavoro 1x con acqua distillata, quindi aggiungere 200 ml di 0,05% blu di metilene per ogni 1 L di 1x E3 di agire come fungicida, e conservare a RT. </li><li> Fare una soluzione pigmentazione blocco di E3 mezzi embrione con 0,003% 1-fenil-2-tiourea (PTU) mediante la combinazione di 40 ml di 50x E3 azione con 0,06 mg PTU. Quindi portare il volume a un totale di 2 L con acqua distillata. </li><li> Mescolare la O E3 / PTU / N a temperatura ambiente per ottenere la polvere PTU in soluzione. Poi memorizzare l&#39;E3 / PTU aRT. Nota: L&#39;E3 / PTU ha una durata di circa una settimana, e le soluzioni più anziani saranno meno efficace nel bloccare lo sviluppo pigmentazione nelle larve zebrafish. </li><li> Effettuare una soluzione anestetica del 0,2% Tricaine (MS-222) aggiungendo 1 g di Tricaine a 500 ml di acqua distillata e regolare il pH a 7,2 con 1 M Tris, pH 9,5. </li><li> Preparare per ottenere una soluzione di metilcellulosa 2% per l&#39;imaging ponendo una soluzione di 1x E3 (senza blu di metilene), con 1/10 volume di 0,2% Tricaine aggiunto a 4 ° C. Nota: La soluzione metilcellulosa è una soluzione di spessore, chiaro che viene utilizzato per stabilizzare delicatamente embrioni vivi per la microscopia. Dopo l&#39;esecuzione manipolazioni gli embrioni possono essere lavati in 1x E3 di sciogliere la metilcellulosa senza ferire l&#39;animale e consentendo la microscopia in fasi successive nello stesso campione. </li><li> Quando raffreddato a 4 ° C, mescolare la soluzione 1x E3 / Tricaine energicamente su un piatto mescolare e aggiungere gradualmente la giusta quantità di metilepolvere di cellulosa, pur continuando a mescolare energicamente. Aggiungere gradualmente la polvere alla soluzione per evitare la formazione di aggregati insolubili metilcellulosa. </li><li> Dopo tutta la polvere viene miscelato nella soluzione di metilcellulosa / E3 / tricaine 2%, mescolare la soluzione composita in C stanza fredda 4 ° O / N. Nota: La temperatura fredda è migliore per sciogliere completamente la polvere. Se la soluzione non è chiara dopo una notte, agitare per una giornata lavorativa supplementare e / o un secondo O / N. </li><li> Per rimuovere le bolle d&#39;aria dalla soluzione / tricaine E3 2% metilcellulosa /, un&#39;aliquota il composto in provette da 1,5 ml e girano ad alta velocità (12.000 xg) a 4 ° C per 30 minuti o fino a 2 ore. </li><li> Mettere la soluzione / E3 / Tricaine metilcellulosa 2% a 4 ° C per una conservazione a lungo termine. Nota: Prima di utilizzo, le aliquote devono essere pre-riscaldato a temperatura ambiente per lavorare con i campioni di zebrafish. </li></ol> 2. Preparazione di strumenti <ol><li> Preparare uno strumento embrione manipolatore, utilizzato per Podi posizionamento a embrioni per la microiniezione, allegando una punta di caricamento del gel sulla punta di un ago da dissezione dritto 5 &quot;, e fissare con nastro adesivo o colla. </li><li> Preparare aghi microiniezione con un estrattore ago, dalla prima immissione un fuoco lucido 10 centimetri in vetro borosilicato con filamento nello strumento e fissare il vetro borosilicato stringendo le maniglie. </li><li> Tirare il vetro borosilicato alla moda aghi fine-conici. Utilizzare le seguenti impostazioni: riscaldare 540, tirare 245, velocità 200, e il tempo 125. </li><li> Luogo aghi all&#39;interno di una capsula di Petri, li sospensione su una striscia di plastilina per proteggere le punte degli aghi, e mantenere il piatto coperto per evitare l&#39;accumulo di polvere. </li><li> Per finire di preparare l&#39;ago per microiniezioni, utilizzare un bordo lama di rasoio o pinza sottile per tagliare l&#39;estremità tirato dell&#39;ago per creare una punta tagliente iniezione angolare con un diametro di circa 0,05-0,1 mm. </li><li> Per rendere il vassoio microiniezione, preparare un 1,5% di agarosio soluzione / E3 in un 100 ml beuta e sciogliere l&#39;agarosio riscaldando il E3 a ebollizione in una microonda indi si lascia raffreddare a temperatura ambiente per circa 10 min. </li><li> Versare la soluzione di agarosio / E3 raffreddato in una capsula Petri di fare una fondazione con una profondità di circa 0,5 CM. Quando questo è solidificato versare un secondo strato con una profondità di circa 0,3 cm ed inserire lo stampo embrione ben prefabbricati e consentire l&#39;agarosio solidificare a temperatura ambiente. Nota: Quando si inserisce lo stampo nello strato / E3 superiore agar, ponendo lo stampo in agar con un angolo di diminuire il numero di bolle d&#39;aria. </li><li> Quando l&#39;intero vassoio microiniezione ha fissato, sollevare l&#39;embrione prefabbricata ben modellare lentamente e accuratamente con un scoopula, quindi riempire il piatto con la soluzione E3 e conservare a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparazione Embrione <ol><li> Impostare serbatoi accoppiamento zebrafish inserendo divisori nelle camere di accoppiamento e riempire con acqua del sistema. </li><li> Posizionare un pesce su ciascun lato del divisore such che ciascuna camera di accoppiamento contiene una femmina e uno di pesce di sesso maschile, e coprire ciascuna camera di accoppiamento. </li><li> La mattina seguente, togliere i divisori per consentire la deposizione delle uova. </li><li> Controllare il pesce dopo circa 30 minuti, e dopo il ritorno gli adulti per l&#39;acquario, raccogliere i loro embrioni facendo passare l&#39;acqua della vasca di accoppiamento attraverso una multa strumento colino rete metallica. </li><li> Invertire il filtro su una capsula di Petri e risciacquare con E3 per raccogliere gli embrioni. </li><li> Incubare gli embrioni a 28,5 ° CO / N. </li><li> Quando embrioni hanno raggiunto la fase 24-26 somite 26, decantare maggior parte dei media E3 e poi dechorionate aggiungendo 100 ml di 50 mg / ml pronase per ogni piatto di embrioni e incubando il piatto a RT (23 ° C) per circa 15 min. Nota: Ci vorranno circa 24-25 ore dal momento della fecondazione per gli embrioni di raggiungere la fase 24-26 somite se sono raccolti nel modo descritto e incubata O / N a 28,5 ° C. </li><li> Riempire il piatto conE3 e poi miscelare delicatamente per rimuovere i chorions dagli embrioni. </li><li> Decantare il E3 / pronasi e sciacquare il piatto con 25 ml di E3 fresco. passo risciacquo Ripetere per rimuovere tutti Pronasi. </li><li> Per bloccare lo sviluppo di pigmentazione, decantare il E3 e sostituire con 25 ml di fresco E3 / PTU quando gli embrioni hanno raggiunto 24 ore dopo la fecondazione. Nota: Per gli esperimenti che abbracciano diversi giorni, sostituire la soluzione E3 / PTU con mezzi freschi una volta al giorno per mantenere il piatto pulito. </li></ol> 4. la microiniezione di soluzione nefrotossina <ol><li> Il giorno dell&#39;iniezione, preparare la soluzione nefrotossina desiderata con il controllo del veicolo appropriato. </li><li> Vortex o mescolare gentilmente per garantire il farmaco (s) è / sono in soluzione, controllando i lati del tubo e superiore della colonna d&#39;acqua. Nota: Le soluzioni nefrotossina possono essere preparati per contenere tracce di fluorescente destrano coniugato a monitorare l&#39;efficienza microiniezione e anche valutare la clearance renale a Collpunti di tempo confluente 20,28. </li><li> Caricare un ago microiniezione rifinito con ~ 2-3 ml di nefrotossina infilando una punta fine caricamento del gel nella parte posteriore dell&#39;ago e di sospendere l&#39;ago verticalmente con un pezzo di nastro per consentire la soluzione per riempire la punta dell&#39;ago rifilato dalla forza di gravità. </li><li> Una volta che la punta dell&#39;ago è pieno, garantire l&#39;ago caricato nel micromanipolatore. </li><li> Testare il volume microiniezione mettendo una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e iniettare nell&#39;olio per valutare la dimensione delle gocce. Un volume di iniezione di 500 pl ha un diametro di 0,1 mm. </li><li> Rimuovere il piatto di embrioni dal termostato, e anestetizzare con l&#39;aggiunta di circa 5 ml di 0,2% Tricaine al piatto dell&#39;embrione. </li><li> Per garantire la completa anestesia, toccare delicatamente embrione con la punta dello strumento dell&#39;embrione manipolatore. La mancanza di movimento indica anestesia sufficiente. </li><li> Dopo anestesia successo, il trasferimento di embrioni allo stampo di iniezione con un trasfER pipetta. </li><li> Manovri ogni embrione in una diversa e dello stampo mettendo la testa nella zona più profonda del pozzo in modo che il tronco appoggia lungo la depressione e la coda sporge dalla depressione. </li><li> Inserire l&#39;ago riempito in micromanipolatore e posizionare la punta dell&#39;ago accanto ad un embrione. </li><li> inserire delicatamente l&#39;ago nel vaso coda spostando il joystick in avanti e premere il pedale del piede per fornire la microiniezione. Nota: iniezione di successo può essere desunta dal guardando il liquido entrare circolazione. Inoltre, co-iniezione della nephrotoxicant con fluorescente destrano coniugato consente al ricercatore di verificare iniezione di successo successivamente alla procedura. </li><li> Delicatamente tirare indietro il joystick per rimuovere l&#39;ago dall&#39;embrione. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, trasferire gli embrioni per un piatto pulito e risciacquare per rimuovere il Tricaine e sostituirlo con fresco E3 / PTU. </li><li> Incubare l&#39;embrione fino al punto desiderato tempo di asinis morfologia, che può essere documentata dalla fotografia in metilcellulosa mezzo di montaggio, o di un processo per l&#39;analisi sperimentale, se lo desideri. Nota: Il recupero di embrioni deve essere valutato per determinare la percentuale di individui con edema, che indica comunemente danno renale. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un svariato numero di agenti terapeutici sono stati associati con AKI 29. Ci sono stati notevoli progressi della ricerca nella comprensione del danno indotto da molti composti individuali, come la gentamicina aminoglicosidi 30 e il cisplatino chemioterapico ampiamente usato 31,32. Alcuni cambiamenti patologici coinvolti in queste condizioni, tuttavia, rimangono oggetto di studio in corso. Una sfida emergente rimane la comprensione di come più farmaci influenzano negativamente i pazienti...

Aki è una perdita improvvisa della funzione renale che può portare a conseguenze per la salute devastanti 1. AKI è un problema sanitario rilevante in tutto il mondo a causa della sua elevata incidenza di circa il 20% tra i pazienti ospedalizzati, con tassi ancora più elevati di 30-50% nei casi di terapia intensiva e gli anziani, e il tasso di mortalità del 50-70% 1-3. Purtroppo, la prevalenza di AKI è in aumento e si prevede a crescere ulteriormente nel prossimo decennio, in parte a causa della diversità dei fattori che possono indurre AKI, che includono stress post-operatorio, ischemia, e l&#39;esposizione a nefrotossine come antibiotici e farmaci chemioterapici 4. AKI comporta danni cellulari improvvisa all&#39;interno del rene, che si verificano comunemente in nefroni, che sono le unità funzionali essenziali, e sono composti da un filtro del sangue e un tubulo segmentato che drena l&#39;urina in collettori centrali 1. Quando un numero significativo di nefroni sonodanneggiato durante AKI, gli effetti immediati di una interruzione della clearance rifiuti dalla circolazione, e il flusso del fluido ridotta o abolita attraverso nefroni a causa di ostruzione da cellule morte e morenti 1. Nel corso del tempo, l&#39;ostruzione tubolare può portare alla degenerazione di intere nefroni, che riduce in modo permanente la funzione renale 1. Alterazioni fisiologiche nel rene seguenti AKI coinvolgono anche eventi infiammatori complessi che possono portare a cicatrici cronica 1. Nonostante questi risultati, nefroni hanno una certa capacità di subire rigenerazione dopo AKI che ricostituisce il 5,6 tubolare dell&#39;epitelio. Mentre vi è stata una comprensione molecolare crescente di rigenerazione nefrone, i meccanismi rimangono sfuggente in molti aspetti e impongono prosecuzione degli accertamenti 7. La misura in cui AKI si traduce in un danno renale permanente rimane sconosciuta. La ricerca attuale suggerisce il potenziale rigenerativo per il rene è lapiù alto dopo meno gravi casi di AKI, mentre gli episodi più pronunciati o ripetute portano alla malattia renale cronica (CKD) e culminano nella malattia renale allo stadio terminale (ESRD) che richiede il trapianto salva-vita o la dialisi 8,9. Inoltre, gli individui già affetti da insufficienza renale cronica sono ad un ancora più elevato rischio di contrarre una grave episodio di AKI 8,9. Nel loro insieme, è chiaro che ha continuato la ricerca di base e clinica è fondamentale per comprendere, trattare e prevenire AKI. La ricerca con modelli animali è stato determinante per apprezzare la progressione delle alterazioni locali e ambientali che si verificano durante AKI 10. Per espandere questa comprensione e sviluppare nuove terapie, il modello animale zebrafish è stato impiegato in una varietà di modi 11,12. I nefroni del rene zebrafish, sia l&#39;embrione e adulti, mostrano un alto grado di conservazione con i mammiferi 13-16. Inoltre, lesioni epiteliali nefrone in zebrafish assomiglia al processo di vertebrati superiori, per cui la distruzione locale del cellule tubulari è seguita da proliferazione intratubulare e ristabilimento di architettura nefrone 17-19. Nell&#39;embrione, però, ingenti danni tubulo dalle nefrotossine come cisplatino è associata a letalità 20,21. In confronto, gli adulti zebrafish sopravvivono AKI e mostrano capacità rigenerative sostanziali nel rene. Ad esempio, dopo l&#39;esposizione al gentamicina antibiotici aminoglicosidi, zebrafish rigenerare tubulo danno epiteliale e far crescere nuove unità nefrone così 22-24. Mentre questi studi AKI gentamicina indotta hanno fornito preziose informazioni, la comprensione danno renale da diversi nefrotossine rimane fondamentale per apprezzare gli effetti e la risposta a diversi tipi di danni 25. L&#39;embrione zebrafish, a causa della sua dimensione, trasparenza, e trattabilità genetica, ha molti vantaggi per gli studi nefrotossina &lt;sup&gt; 25, in cui il metodo di microiniezione 20,21 viene utilizzato per gestire la molecola (s) per indagini. Nefroni sono formate da 24 ore dopo la fecondazione (HPF) e cominciano a filtrare il sangue di circa il 48 HPF 26,27. Così, la rapida formazione e la funzione del rene embrionale facilita analisi sperimentale. Tuttavia, il processo di microiniezione ha sfide tecniche e non ci può essere una ripida curva di apprendimento per padroneggiare la tecnica. In questo articolo il video, si descrive come eseguire microiniezioni e fornire suggerimenti sulla risoluzione dei problemi al fine di migliorare il tasso di iniezioni di successo.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;(microinjection tray) 150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezer</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Micrometer</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>2280-24</td><td></td></tr></tbody></table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

I reni sono suscettibili di nuocere dall&#39;esposizione a sostanze chimiche che filtrano dal flusso sanguigno. Questo può portare a lesioni d&#39;organo associata ad un rapido declino della funzione renale e lo sviluppo della sindrome clinica nota come danno renale acuto (AKI). agenti farmacologici usati per trattare le circostanze mediche che vanno da un&#39;infezione batterica al cancro, quando somministrato singolarmente o in combinazione con altri farmaci, possono avviare AKI. Zebrafish sono un modello animale utile per studiare gli effetti chimici sulla funzione renale in vivo, in quanto costituiscono un rene embrionale composto di unità funzionali nefrone che sono conservati con vertebrati superiori, compreso l&#39;uomo. Inoltre, zebrafish può essere utilizzata per eseguire schermi genetici e chimici, che offrono opportunità per chiarire gli aspetti cellulari e molecolari di AKI e sviluppare strategie terapeutiche, come l&#39;identificazione di molecole nefroprotettivo. Qui, dimostriamo come microiniezione nelzebrafish può essere utilizzato come un paradigma per gli studi nefrotossina.

Una stazione di microiniezione istituito comprende uno stereomicroscopio, micromanipolatore e regolatore di pressione (Figura 1A). Transilluminazione della piastra iniezione è preferibile visualizzare campioni durante questa procedura (Figura 1B). Preparazione dell&#39;ago iniezione coinvolge tirando il vetro borosilicato appropriata, seguita preparando il bordo con taglio e back-caricare l&#39;ago fine. In modo ottimale, la punta dell&#39;ago è smussa...

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Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Views.  University of Notre Dame.  lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi. 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Test della barriere fisiologiche di trasmissione virale in Afidi Utilizzando Microiniezione

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modello di lesione renale acuta indotto dal cisplatino nel pesce zebra adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicina

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Source: McKee, Robert A. et al. <a href="https://www.jove.com/video/54241" target="_blank">Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

Microiniezione endovenosa di nefrotossine nell'embrione di zebrafish: una tecnica per rilasciare agenti nefrotossici nel flusso sanguigno dell'embrione di zebrafish

Source: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the ...