L'obiettivo generale di questa procedura, viene spiegato l'uso del cisplatino come agente nefrotossico nei pesci zebra adulti, analizzando l'infiammazione e la morte cellulare nel tessuto renale. Per raggiungere questo obiettivo e il pesce zebra adulto viene anestetizzato e pesato per iniettare una dose specifica di cisplatino nella cavità peritoneale. Dopo aver monitorato la mortalità, il rene viene sezionato e le cellule sono isolate per la citometria del flusso o fissate e sezionate per essere analizzate con test TUNEL fluorescenti.
Le seguenti procedure possono aiutare a rispondere a domande chiave in campo renale utilizzando gli effetti nefrotossici del cisplatino come strumento per sviluppare un modello di lesione renale acuta e pesci zebra adulti. Questo modello può essere utilizzato per l'esplorazione di nuovi obiettivi terapeutici nella protezione renale, oltre ad chiarire il meccanismo di rigenerazione nel rene del pesce zebra. Il cisplatino è un agente chemioterapico usato per trattare una varietà di cancro.
Tuttavia, può facilmente accumularsi nel rene, generando morte cellulare, infiammazione e diminuzione della funzione renale. L'effetto del cisplatino dipende dalla dose, quindi puoi ridurre il nostro aumento del consumo dipende dai tuoi obiettivi. Le tecniche utilizzate qui per analizzare l'infiammazione e la morte cellulare non sono esclusivamente per la diffusione del modello della malattia.
La citometria a flusso nei pesci zebra può aiutare ad chiarire gli stati infiammatori dell'animale in modo quantitativo, mentre in TUNEL diciamo che può chiarire la presenza di cellule poptosed nei contesti fisiologici e patologici. Prima di iniziare l'esperimento, preparare la soluzione di lavoro del cisplatino diluire la soluzione stock a 820 microgrammi per mil in cloruro di sodio allo 0,9%. Successivamente, anestetizza un altro pesce zebra e asciuga l'eccesso di acqua su alcuni tovaglioli di carta.
Pesare il pesce posizionandolo su una bilancia, prendendo nota del peso. Effettuare i calcoli per conoscere il volume esatto da iniettare. Per ottenere la dose di 120 microgrammi per grammi di peso, utilizzare la formula successiva.
Dividere la dose finale per la dose della soluzione di lavoro e convertire questo numero in microlitri, moltiplicando per 1000 per ottenere il volume di 120 microgrammi di cisplatino. Quindi, moltiplica questo numero per il peso del pesce per ottenere il volume finale da iniettare. Posizionare un pesce su una spugna bagnata, con una piccola tazza per tenerlo.
Con il lato ventrale verso l'alto e riempire una siringa di insulina con un volume calcolato di cisplatino. Inserire l'ago sulla linea mediana ventrale in un angolo poco profondo, tirando delicatamente la parete ventrale verso l'alto per evitare di forare organi interni. E poi iniettare la soluzione.
Dopo l'iniezione, mettere un pesce in un serbatoio per riprendersi dall'anestesia e attendere segni di recupero come nuoto e movimenti appropriati. Monitora per quei pesci due volte al giorno per i prossimi giorni. A questa dose, il cisplatino induce circa il 30% della mortalità nelle prime 24 ore.
Eutanasia il pesce e asciugare l'eccesso di acqua in un tovagliolo di carta. Dopo aver rimosso la testa e gli organi interni, utilizzare aghi di dissezione per appuntare le pareti del corpo. Individuare il rene nella parete dorsale del pesce e utilizzare le forcep per staccare il rene.
Posizionare il rene in una piastra a sei po pozza con una soluzione fresca di un PBS 1X, 2%FBS e tenere sul ghiaccio. Successivamente, raccogliere il tessuto con del liquido e passarlo attraverso un colino cellulare da 40 micron e macerare delicatamente il tessuto con uno stantuffo per siringhe. Lavare due volte con un PBS 1X, 2%FBS.
E raccogliere le cellule in un tubo di falco da 50 mils. Quindi centrifugare per cinque minuti a 400 G.Careful pickup il supernatante con una pipetta e scartarlo. Aggiungere 500 microlitri di PBS freddo 1X per sospendere di nuovo le celle e posizionarle in un tubo di citometria a flusso di cinque mils.
Tienili sul ghiaccio. Prendi 10 microlitri del campione e mescolalo con 90 microlitri di blu trypan in un tubo Eppendorf. Aggiungere 10 microlitri della miscela a una camera Neobauer e contare le cellule al microscopio.
Prendi le cellule per essere lette da un citometro, quindi analizza i risultati selezionando la popolazione dei tuoi interessi. Per questa procedura, eutanasiare un pesce e rimuovere gli organi interni lasciando il rene attaccato al corpo. Quindi, fissare le pareti del corpo su una superficie di sughero e posizionarla gradualmente verso il basso sulla soluzione di fissazione.
Tienilo a quattro gradi durante la notte. Il giorno dopo, sezionare il rene con un forcipe fine. Cerca di non disturbarlo.
Mettilo in una piccola piastra di Petri o in un tubo Eppendorf con 1X PBS per risciacquare. Cambiare il PBS e preparare il 2%agarosio per generare una matrice di supporto per il rene prima che si evolvano solidamente. Scartare tutti i PBS rimanenti e versare lentamente l'agarosio.
Quindi, posizionare il rene con forcep fini per evitare che si pieghi. Lasciare che l'agarosio si solidifichiamo a temperatura ambiente. Dopo la solidificazione dell'agarosio, utilizzare un bisturi per tagliare l'agarosio intorno ai reni formando un piccolo cubetto.
Posizionare i cubi di agarosio all'interno di una cassetta istologica e inviarli per l'elaborazione istologica per incorporare il tessuto in paraffina. I blocchi di paraffina, taglieremo quindi in cinque sezioni di spessore di micron. Sgonfonda gli scivoli e conservali in acqua distillata.
Preparare una camera di incubazione scura, mettendo gli asciugamani di carta bagnata sul fondo. Posizionare le diapositive nella camera scura e aggiungere proteinasi K per la permeabilizzazione del tessuto. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Mentre i campioni vengono incubati, preparare la miscela di reazione TUNEL, aggiungendo 50 microlitri di soluzione enzimatica su 450 microlitri di soluzione di etichetta. E tenersi al protetto dalla luce. Raccogliere la camera scura e lavare la fetta due volte con un PBS 1X.
Quindi, asciugare le diapositive e sulla miscela di reazione TUNEL. E incubare a 37 Gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, lavare nuovamente questo diapositive con un PBS 1X.
E aggiungere DAPI per la colorazione del contatore dei nuclei. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti, protetto dalla luce. Risciacquare tre volte con un PBS 1X.
E poi, modellare le diapositive con un mezzo idrofilo anti-dissolvenza. Posizionare una lapsus. E sigillare con smalto per unghie.
Visualizzare i campioni in un microscopio fluorescente. In questo grafico, è possibile vedere che il cisplatino ha un effetto di risposta alla dose sulla sopravvivenza dei pesci, rispetto a un controllo iniettato solo con cloruro di sodio allo 0,9%. La linea rossa in questo grafico rappresenta una dose di 120 microgrammi per grammi utilizzati in questo video.
Queste dosi possono essere applicate a maschi e femmine, poiché non è stata riscontrata alcuna differenza statistica tra loro. La citometria a flusso consente di quantificare diverse cellule presenti in un tessuto. Le popolazioni di cellule ematopoietiche sono identificate nel rene di diversi pesci per dimensione o dispersione in avanti e granularità o dispersione delle dimensioni.
In questo modo, è possibile separare le popolazioni in eritetrociti, linfociti, granulociti e precursori ematopoietici. Qui, l'attuale strategia di gate selezionando i granulociti, le singolette e le cellule positive MPO permettono di trovare la popolazione dei neutrofili nel rene segnata dall'espressione di fluorescenza della mieloperossidasi. In questo caso, l'iniezione di cisplatino ha indotto l'aumento della percentuale di neutrofili presenti nel rene.
Il saggio TUNEL permette di rilevare le cellule apoptotiche in un tessuto osservando lo scivolo tissutale del rene da un microscopio a fluorescenza, è possibile vedere il segnale apoptotico all'interno dei nuclei di alcune cellule, qui in rosso. Contrastato da una macchia nucleare in un tale DAPI qui in blu. L'iniezione di cisplatino ha aumentato la presenza di cellule apoptotiche nel rene, che sono possibili quantificare manualmente o utilizzando un software di immagine.
Alla fine di questo video dovresti essere in grado di sapere come iniettare e regolare la dose di cisplatino per indurre lesioni renali acute nei pesci zebra adulti. E come sezionare il rene per scopi diversi. La citometria a flusso è uno strumento eccellente che ti aiuterà a comprendere il profilo di diversi tipi di cellule dipendenti dalla disponibilità di linee di tragenclave nel tuo laboratorio.
Ricordarsi di considerare il colore delle linee dei trasportatori se si desidera utilizzare anticorpi per etichettare tutti i loro tipi di cellule. Il saggio TUNEL è un semplice strumento che ci permette di rilevare cellule e tessuti apoptotici e può essere analizzato non solo per microscopia, ma anche per citometria a flusso. Ricorda, usa sempre dispositivi di protezione individuale durante l'intera procedura.
