Vorremmo ringraziare Michael Feyder e Terrell Holloway per la loro assistenza durante la configurazione iniziale della tecnica e laboratorio del Dr. Fumi Ono s per l&#39;accesso ai loro microscopio confocale. Questa ricerca è stata finanziata dal National Institute of Health attraverso il programma intramurale del NIAAA e NINDS.

1. Preparazione DII / Tungsteno Bead Bullets: DII (1-1&#39;-Dioctadecyl-3, 3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato) proiettili devono essere preparati in anticipo di tagliare fettine di cervello. La procedura richiede circa 2-4 ore a seconda di quanti proiettili sono preparati in una volta. <ol><li> Se a partire da un nuovo lotto di perline di tungsteno, preparare aliquote di 300 mg ciascuna. Aliquote sono preparati con la sospensione 6 grammi di tungsteno in 2 ml di cloruro di metilene. Poi, pipettare 100 l di soluzione tallone in tubi microcentrifuga per la produzione di aliquote di perle da 300 mg di tungsteno aliquote Conservare a temperatura ambiente (Nota: cloruro di metilene evapora con estrema rapidità alcol può essere utilizzato anche ridurre al minimo l&#39;evaporazione).... </li><li> Quando a partire da aliquote di perline, risospendere ciascuna aliquota (300 perle di tungsteno mg) in 300 ml di cloruro di metilene e coprire rapidamente per evitare l&#39;evaporazione. Questa quantità è sufficiente per 3 lotti di proiettili. </li><li> Preparare la soluzione colorante pesando 13,5 mg di lipofile DII colorante e aggiungendo 450 ml di cloruro di metilene (concentrazione finale = 3mg/100μl). </li><li> Rivestire le perline con colorante. Posizionare un vetrino su un pezzo di cera rivestite di carta pesano e pipettare 100 l di perline sul vetrino. Aggiungere 100 ml di soluzione Dii, mescolare accuratamente con puntale, e aria secca fino perle turno grigio chiaro. </li><li> Utilizzare una lama di rasoio per raschiare perline fuori dal vetrino e tagliare le perle in una polvere fine (Nota: utilizzare una nuova lama se facendo più di un colore di proiettili in modo da non contaminare coloranti).. </li><li> Perline raschiare sul peso perline di carta e imbuto in un tubo da 15 ml. Aggiungere 3 ml di acqua e sonicare a bagnomaria per 10-30 minuti a temperatura ambiente (Nota: dadi della polvere e sonicazione vengono applicati per minimizzare la formazione di grumi rivestito di perline che interromperà l&#39;etichettatura sparse dei singoli neuroni).. </li></ol> 2. Preparazione polivinilpirrolidone (PVP) soluzione e tubazioni: per migliorare l&#39;attaccamento tallone per il tubo proiettile (tubi TEZFEL), rivestimento con polivinilpirrolidone (PVP) soluzione. <ol><li> Preparare 10 ml di soluzione di PVP in acqua ad una concentrazione di 10 mg PVP / ml. </li><li> Utilizzare una siringa da 12 ml con adattatore per tubi (tubi flessibili con diametro leggermente più grandi) per passare il PVP soluzione attraverso il tubo proiettile e poi espellerla fuori dall&#39;altra parte. Riutilizzo soluzione per tubi cappotto più proiettile se diversi lotti sono preparati contemporaneamente. Scartare la soluzione PVP dopo l&#39;uso. </li><li> Per aggiungere le perle al tubo proiettile, vortice le perle per produrre una soluzione omogenea e usare la siringa per tirare il tallone soluzione attraverso il tubo in modo che le microsfere sono equamente distribuiti in tutto il tubo. ((Nota:) cercano di minimizzare il numero di bolle d&#39;aria nel tubo). </li><li> Far passare il tubo attraverso la stazione di preparazione e permettono di risolvere le perline. Usare la siringa per rimuovere delicatamente l&#39;acqua in modo che solo le perline rimangono. </li><li> Spin il tubo nella stazione di preparazione e asciugare con azoto fino gocce d&#39;acqua non sono più visibili. Questa fase dura circa 10-20 minuti. </li><li> Tagliare proiettili con taglierina tubi in 13 mm di lunghezza e il luogo in fiale di scintillazione contenenti Drierite o un qualche tipo di solfato di calcio anidro. Avvolgere in un foglio di fiale al riparo dalla luce. </li></ol> 3. Colorazione Dii: questa tecnica l&#39;etichettatura può essere usata per colorare i neuroni nel tessuto cerebrale da specie diverse, in questo caso particolare, da topo (3-6 mesi) e primati non umani (9-15 anni). E &#39;preferibile che le fette sono preparati dal tessuto cerebrale fisso ottenuto dalla perfusione transcardiac di soluzione fissativo perché la conservazione dei tessuti dovrebbe essere migliore in questa condizione. Tuttavia, la fissazione per perfusione non è sempre possibile (come è avvenuto con il tessuto scimmia) ed etichettatura DiOLISTIC può ancora essere applicata con successo in diverse procedure di preparazione dei tessuti. Qui si descrivono tre diverse procedure per la preparazione dei tessuti: <ol class="lalpha"><li> Fix per perfusione cerebrale transcardiac → rimuovere cervello → postfix per 10 min → fetta tagliata → macchia </li><li> Rimuovere cervello → blocco taglio del tessuto → blocco fissare → lavare in PBS → fetta tagliata → macchia </li><li> Togliere le fette tagliate cervello → → → fissare lavare → macchia </li></ol> Nel presente studio, i cervelli di scimmia sono stati ottenuti da soggetti che sono stati transcardially perfusi con ghiaccio freddo artificiale fluido cerebro-spinale (ACSF) prima del raccolto del cervello e un blocco (4 mm di spessore) di tessuto che contiene il caudato uno° putamen è stata fissata per 60 minuti a temperatura ambiente. Per tutte le procedure, la soluzione fissativa contiene paraformaldeide 4% e il 4% di saccarosio in PBS (preparato fresco o usato entro 15 giorni). E &#39;importante notare che i tempi di fissazione sono fondamentali per la colorazione di successo. Overfixation può influenzare colorazione interrompendo l&#39;integrità della membrana plasmatica e causando tintura a fuoriuscire dalla cellula (ulteriori informazioni in risultati). <ol><li> Per la procedura a e b, fette (200μm) sono tagliati dal cervello fisso o il blocco dei tessuti e fette collocati in 24 pozzetti con PBS. Per la procedura c, fresche fette cerebrale acuta (200 micron) vengono tagliati con un vibratome taglio a freddo in soluzione contenente (in mm) 110 colina-Cl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2.5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 25 di glucosio, 11,6 acido ascorbico, acido piruvico 3,1 (osmolarità mOsmols = 310) e subito dopo fette sono posti in piastre da 24 pozzetti e fissato per 30 minuti con la soluzione fissativa a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le fette con PBS, 3 volte. </li><li> Prima di fette di tiro, togliere il PBS dai pozzi e, utilizzando un pennello, mettere la fetta al centro del pozzo. </li><li> Spara proiettili DII tramite carta 3,0 micron filtro con un sistema Helios Gun Gene a 120-180 psi di pressione del gas elio mettendo la pistola ad una distanza di 1,5 cm tra il campione e la fine della canna. (Nota importante:. Soltanto in neuroni nel raggio di 50 mm della superficie fetta saranno etichettati con questo metodo per cui è importante mantenere la stessa parte della fetta rivolto verso l&#39;alto durante il lavaggio e per il montaggio in questo modo, si farà in modo che il neuroni marcati saranno a breve distanza focale quando l&#39;imaging con un microscopio confocale). </li><li> Lavare le fette di 3 volte con PBS e memorizzarli in PBS per diverse ore per consentire al DII a diffondersi lungo i dendriti. </li><li> Montare le fette su un vetrino con Prolungare Antifade oro e coprire con un coprioggetto 18x18 millimetri No.1. (Nota: per c procedura, è meglio montare fette il giorno stesso l&#39;integrità delle fette non è ben tenuto durante la notte). </li><li> Sigillare con smalto trasparente dopo il montaggio dei media si è asciugato. </li><li> In alternativa, le fette possono essere colorati con gli anticorpi prima di montare come descritto di seguito. (Nota: Le diapositive possono essere utilizzate da almeno 6 mesi a un anno se conservata al buio a 4 ° C. DII è leggero e sensibile esposizione a lungo termine alla luce provoca la macchia a svanire). </li></ol> 4. Colorazione anticorpale: immunocolorazione deve essere eseguita dopo passo 3.4 e prima del montaggio. <ol><li> Permeabilizzazione: fette Incubare a 0,01% Triton X-100 in soluzione PBS per 15 minuti a temperatura ambiente (300-500 microlitri per pozzetto). NOTA: non utilizzare concentrazioni più elevate di detersivo come questa si dissolverà DII e ridurre significativamente la colorazione fluorescente. Cercare di minimizzare il tempo di detergente come incubazioni ampia ridurrà anche l&#39;etichettatura DII. Se incubazioni estesi sono necessari, tenere le fette in PBS, piuttosto che a bloccare soluzione. </li><li> Blocco: fette Incubare a bloccare soluzione contenente siero di capra 10%, 0,01% Triton X-100 in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Anticorpo primario: Aggiungi anticorpo alla diluizione desiderata nella soluzione bloccante (coniglio ad esempio anticorpi anti-GFP in diluizione 1:1000). Aggiungere 300-500 microlitri per pozzetto e incubare per 1-2 ore. (Nota: se durante la notte sono incubazione necessario, togliere dal blocco soluzione detergente). </li><li> Lavare le fette con PBS per 5 - 15 min, 3 volte. </li><li> Anticorpo secondario: Incubare con anticorpo secondario per 30 minuti a temperatura ambiente. Preparare la soluzione secondaria di anticorpi alla diluizione desiderata nella soluzione bloccante (per esempio Alexa Fluor 488-coniugato a diluizione 1:1000). </li><li> Lavare le fette con PBS per 5-15 minuti, 4 volte. </li><li> Monte fette su vetrini con Prolungare Antifade oro e coprire con un coprioggetto 18x18 millimetri No.1. Sigillare con smalto dopo il montaggio dei media si è asciugato. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <ol><li> Verifica della corretta etichettatura: sezione possono essere visualizzate in un ambito di applicazione fluorescente dissezione dotato di una lampada al mercurio e rosso fluorescente cubo filtro per confermare il successo di etichettatura DiOLISTIC. La figura 1 mostra le immagini di sezioni del cervello esemplare ben marcato ottenuto a basso ingrandimento. Due caratteristiche importanti per cercare un modello di etichettatura sono sparse (Figura 1A) e la capacità di identificare i singoli componenti cellulari (Figura 1B-C). </li&gt; <li> L&#39;etichettatura dei problemi DiOLISTIC: La figura 2 mostra esempi di sezioni in cui l&#39;etichettatura DiOLISTIC lavorato in modo errato. Nella nostra esperienza, ci sono tre cause principali per l&#39;etichettatura inefficiente: <ul><li> Etichettatura è troppo rada o fitta: le cellule Pochissimi sono etichettati per sezione, in un caso o troppe cellule sono etichettati prevenire l&#39;isolamento e lo studio dei singoli elementi cellulari. Soluzione: regolare la concentrazione di perline rivestito nella soluzione finale utilizzato per il rivestimento dei tubi proiettile TEFZEL (sezione 1.6). Diminuire o aumentare il volume di acqua (3 ml valore iniziale) utilizzato per sciogliere le perle al fine di correggere per l&#39;etichettatura di troppo scarsa o troppo denso, rispettivamente. Inoltre, bassa efficienza di etichettatura potrebbe essere causato da meno di pressione del gas ottimale durante le riprese le perline rivestiti sulla sezioni. Questa possibilità può essere esclusa facendo in modo che il tubo proiettile TEFZEL ha rilasciato la maggior parte delle perle rivestito e appare chiaro dopo lo scatto. In caso contrario, la pressione del gas per le riprese dovrebbero essere aumentati. </li><li> Proiettili Bad: zolle di grandi dimensioni o gruppi di materie coloranti tungsteno rivestiti perle si formano durante la preparazione proiettile. Sezioni somiglierà esempi della Figura 2A-B. Soluzione: fare proiettili nuovo con particolare attenzione al punto 1.5 e / o estendere il tempo di sonicazione nella sezione 1.6. </li><li> Over-fissazione: il tessuto è mantenuto in soluzione paraformaldeide più a lungo del tempo in modo ottimale per il fissaggio (30 minuti di 200-300 micron sezioni, 1 ora per 4 sezioni mm). Questo compromette l&#39;integrità della membrana plasmatica e produce sezioni etichettate che assomigliano a quelli mostrati nella figura 2C-D in cui l&#39;etichettatura sembra fuori fuoco a causa della dispersione di colorante fuori delle cellule. Soluzione: ridurre i tempi di fissazione. </li></ul></li><li> Confocale: pile immagini vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale (Zeiss LSM 510 META) con un obiettivo 20x per tutta la cella e 63x obiettivo immersione in acqua per i segmenti di dendriti. Dii era eccitato con un DPS linea laser 561 nm e fluorescenza verde dal anticorpo secondario è stato eccitato con una linea di laser a 488 nm. Il sezionamento ottico del campione etichettato ottiene quando usando la microscopia confocale consente inoltre per l&#39;isolamento di singole cellule marcate nel campione. Figura 3A mostra un striato neurone spinoso medio dal cervello di topo e il suo complesso disegno ramo dendrite. Immagini ad alto ingrandimento di rami dendrite di questi neuroni di roditori (Figura 3B) e primate non umano (Figura 3C) dimostrano il grado di colorazione in dendriti e spine dendritiche usando questa tecnica in entrambe le specie. Dendriti e le loro sporgenze (spine) appaiono ben definite, anche quando si considera la lunga e sottile colonna vertebrale teste così abbondante nei neuroni spinosi di media. Quando si combinano con DiOLISTICS immunostaining, l&#39;imaging confocale è utile anche per localizzare in modo inequivocabile la macchia allo stesso piano focale e la stessa cella. Figura 4 mostra un esempio di colocalizzazione di DII etichettatura e immunocolorazione per GFP in una singola cella. L&#39;immagine è una pila (0,7 micron z-sezione) ottenuto da una fetta striato da un topo transgenico che esprime la proteina fluorescente GFP sotto il promotore del recettore della dopamina D1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Dii etichettatura dei neuroni in fettine di cervello di primati non umani. (A) a basso ingrandimento immagine di una fetta cervello colorato che contiene il nucleo caudato da una scimmia cynomolgus che mostra l&#39;etichettatura sparse di neuroni con DII. (BC) Isolati neuroni spinosi medi possono essere facilmente identificati utilizzando un ambito fluorescente dissezione. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Risoluzione dei problemi di etichettatura DiOLISTIC. (AB) fette colorato da striato dorsale della scimmia (A) e mouse (B), che mostra grandi ciuffi di colorante rivestite perline e, di conseguenza, non i singoli elementi cellulari possono essere distinti. (CD) Le immagini che esemplificano il risultato dell&#39;applicazione DiOLISTIC l&#39;etichettatura di sezioni che sono stati tenuti in soluzione fissante per periodi prolungati di tempo o in cui la conservazione dei tessuti fallito scimmia (C) e mouse (D) dei tessuti. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Immagine confocale di neuroni spinosi striatali medio macchiata di DII. (A), serie di immagini di una cellula intera permette di analisi morfologica dei rami dendritici. (BC) segmenti Dendrite da mouse (B) e scimmie (C) neuroni spinosi di media mostrano una chiara etichettatura dei dendriti e spine. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Combinando l&#39;etichettatura DiOLISTIC con immunocolorazione. (A) DII etichettati <sTrong&gt; medio spinoso neurone da striato di GFP BAC topi transgenici che esprimono sotto il promotore del recettore della dopamina D1. (B) immunocolorazione con l&#39;utilizzo di anticorpi anti-GFP come descritto da metodi adattato da Lee et al. (2006). Stesso campo A. (C) immagine composita di rosso e di fluorescenza verde identifica DII-etichettato come un neurone GFP-positive neurone.

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOLISTIC"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).</li><li>Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+labeling+of+neuronal+populations+by+ballistic+delivery+of+fluorescent+dyes.">Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes.</a> Methods. 30, 79-85 (2003).</li><li>Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+dendritic+spine+formation+in+D1+and+D2+dopamine+receptor-containing+medium+spiny+neurons+in+nucleus+accumbens.">Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).</li><li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin.">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).</li><li>Neely, S. t. a. n. w. o. o. d., Deutch, G. D., Y, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+diOlistic+labeling+with+retrograde+tract+tracing+and+immunohistochemistry.">Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry.</a> J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).</li><li>Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+spine+plasticity+in+cocaine-+withdrawn+rats.">Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats.</a> J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).</li></ol>

Tutte le procedure di animali sono state eseguite seguendo la guida dalla cura degli animali e del Comitato uso in NIAAA e la Nazionale dell&#39;Oregon Primate Research Center. Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Etichettatura DiOLISTIC è una delle tecniche più versatili disponibili per le cellule fluorescenti etichettatura perché può essere applicato a sezioni di tessuto da specie diverse, ad una vasta gamma di età, e di tessuti ottenuti fresche o da fissativo-perfuso animali (vedi anche Gan et al ., 2009). Il processo è relativamente veloce come ci vogliono 1-2 giorni e può essere combinato con altri approcci un&#39;etichettatura più classici come immunocolorazione (Lee et al., 2006). Particolare attenzione deve essere prestata per evitare un eccesso di fissaggio e l&#39;uso di alte concentrazioni di detergenti in soluzioni di incubazione perché questi comprenderà l&#39;integrità delle membrane lipofile e causare il colorante a trapelare delle cellule. Penetrazione anticorpo può essere facilitata da basse concentrazioni di Triton X-100 (Lee et al., 2006), così come digitonina saponina o nella soluzione di incubazione (Matsubayashi et al., 2008). Alcune modifiche che possono essere applicati a questa tecnica includono l&#39;uso di proiettili con coloranti diversi come descritto da Gan et al. (2000) o cambiare la lunghezza e il tipo di esposizione anticorpi (Neely et al., 2009). Tradizionalmente, DII è stato utilizzato per tracciare le proiezioni dei neuroni nel cervello. Etichettatura DiOLISTIC espande la sua applicazione con la descrizione di un metodo utile per esaminare la morfologia cellulare. Morfologia neuronale è di grande interesse a causa della grande diversità trovano nel cervello e la speculazione che la forma delle cellule potrebbe riflettere sulla molteplicità funzione delle popolazioni neuronali del sistema nervoso. Un esempio di questo è il fatto che molti neuroni in sporgenza display del sistema nervoso dei mammiferi di piccole chiamato spine dendritiche, che sono il sito di sinapsi glutammatergica. In questo modo, la densità di sinapsi glutammatergica su una cella può essere correlata alla densità delle spine dendritiche, che può essere misurato utilizzando la tecnica di etichettatura qui descritti. Inoltre, altri parametri morfologici come dendrite lunghezza totale, modello di ramificazione, la forma della colonna vertebrale dendritica e la densità può essere quantificata e studiata. L&#39;uso di etichette fluorescenti per lo studio della morfologia neuronale ha molti vantaggi rispetto alle tecniche più tradizionali che si basano sulla microscopia in campo chiaro (es. colorazione di Golgi) perché permette di avere immagini ad alta risoluzione confocale. Un altro vantaggio di usare DII come fluoroforo in esperimenti volti a misurare la densità dendritica e la morfologia della colonna vertebrale è la sua proprietà lipofile. Partizioni Dii nella membrana plasmatica e fornisce un profilo ben definito dei processi neuronali e sporgenze dendritiche. Dato il piccolo volume della maggior parte delle spine dendritiche (meno di 1 femtoliter), marcatura di membrana più efficiente e permette una migliore visualizzazione di piccole, sottili protrusioni di colorazione citoplasmatica.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1-1&#x2019;-dioctadecyl-3,3,3&#x2019;,3&#x2019;- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>H485-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2269</td>
<td>1.7 &mu;m diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyvinylpyrrolidone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>529504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tefzel bullet tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing cutter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2422</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2431</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore membrane filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>3.0 &mu;m pore size</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold Antifade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>30525-89-4</td>
<td>(16% w/v)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices

Colorazione DiOLISTIC usa la pistola del gene per introdurre coloranti fluorescenti, come Dii, in neuroni di fette di cervello (Gan et al, 2009;. O&#39;Brien e Lummis, 2007; Gan et al, 2000).. Qui fornire una descrizione dettagliata di ogni passo necessario insieme con le immagini esemplare di risultati buoni e cattivi che aiuteranno durante l&#39;impostazione della tecnica. Nella nostra esperienza, a pochi passi dimostrato fondamentale per la corretta applicazione delle DiOLISTICS. Queste considerazioni sono la qualità del DII rivestite proiettili, il grado di esposizione fissativo, e la concentrazione di detersivo utilizzato nelle soluzioni di incubazione. Suggerimenti e soluzioni per i problemi più comuni sono forniti. Questa è una tecnica di etichettatura versatile che può essere applicato a specie animali più a una vasta gamma di età. A differenza delle altre tecniche di marcatura fluorescente che sono limitati alle preparazioni di animali giovani o ristrette per topi perché si basano su l&#39;espressione di un transgene fluorescente, l&#39;etichettatura DiOLISTIC può essere applicato ad animali di ogni età, specie e genotipi e può essere utilizzato in combinazione con immunocolorazione per identificare una sottopopolazione di cellule. Qui mostriamo l&#39;utilizzo di DiOLISTICS ai neuroni etichetta in fettine di cervello di topi adulti e adulti primati non umani con lo scopo di quantificare dendrite ramificazione dendritica e la morfologia della colonna vertebrale.

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Dimostriamo l&#39;uso della pistola gene di introdurre coloranti fluorescenti, come Dii, in neuroni in fettine di cervello di roditori e primati non umani di età diverse. In questo caso particolare, noi usiamo topi adulti (3-6 mesi) e adulti scimmie cynomologus (9-15 anni). Questa tecnica, originariamente descritta dal laboratorio del Dr. Lichtman (Gan<em&gt; Et al</em&gt;., 2000), è particolarmente adatto per lo studio delle ramificazioni dendritiche e morfologia spine dendritiche e può essere combinato con immunostaining tradizionale, se detergenti sono tenute ad una bassa concentrazione.

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

diolistic-labeling-neurons-from-rodent-non-human-primate-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K Views.  NIH. Dimostriamo l'uso della pistola gene di introdurre coloranti fluorescenti, come Dii, in neuroni in fettine di cervello di roditori e primati non umani di età diverse. In questo caso particolare, noi usiamo topi adulti (3-6 mesi) e adulti scimmie cynomologus (9-15 anni). Questa tecnica, originariamente descritta dal laboratorio del Dr. Lichtman (Gan Et al., 2000), è particolarmente adatto per lo studio delle ramificazioni dendritiche e morfologia spine...

Video: DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Ricerca

Neuroscienze

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...