Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Programma New Innovator il direttore NIH Award, parte del NIH Roadmap per la ricerca medica, attraverso il numero di concedere 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. Desideriamo ringraziare la NSF per una borsa di studio Graduate Research.

1. Pre-elaborazione del tessuto di preparazione <ol class="lalpha"><li> Prima di utilizzare questo protocollo, si deve avere già decellularized il tessuto di scelta. Per questo esempio, suina fresca e campioni pericardio umano sono decellularized con risciacqui ipotoniche e ipertoniche in deionizzata (DI) e dodecil solfato di sodio (SDS). </li><li> In particolare, prima lavare il pericardio porcino in acqua deionizzata per 30 minuti, quindi mescolare continuamente in 1% SDS a tampone fosfato (PBS) per 24 ore, seguito da un ore di acqua 5 di risciacquo. Per pericardia umana, primo risciacquo in acqua deionizzata per 30 minuti, quindi mescolare continuamente in SDS 1% in PBS per 60-65 ore, seguito da un giorno all&#39;altro DI risciacquare. Rimuovere tutti i campioni da loro soluzione finale e sciacquare ancora sotto l&#39;acqua deionizzata 1. </li><li> Per verificare decellularization, rimuovere un piccolo pezzo, fresco congelare nel medio Ottobre congelamento, e prendere 10 sezioni di tessuto micron ogni 100 micron in tutto il campione per l&#39;esame mediante analisi istologica, come precedentemente riportato 34-36. </li><li> Usa ematossilina ed eosina (H &amp; E) le macchie di esaminare il tessuto per l&#39;assenza di nuclei. Si potrebbe anche usare un fluorescenti Hoescht 33342 macchia (1,0 mg / ml) per il DNA per verificare la H &amp; risultati e, per breve tempo, fissare le sezioni, reidratare e sciacquare in acqua, macchia per 10 minuti, poi sciacquare bene e conservare al buio. In alternativa, si può utilizzare un kit come il sangue Qiagen DNeasy e kit di tessuti, che ha lo scopo di quantificare il contenuto totale di DNA di un campione. </li></ol> 2. Preparazione di iniettabili ECM <ol class="lalpha"><li> Liofilizzazione <ol class="lroman"><li> Dopo la preparazione del caso, congelare i campioni decellularized con azoto liquido o con l&#39;archiviazione a -80 ° C. Liofilizzare i campioni fino a completa asciugatura. A seconda del sistema e il contenuto d&#39;acqua dei vostri campioni, questo può richiedere da 12 a 72 ore. </li></ol></li><li> Fresatura <ol class="lroman"><li> Una volta completamente asciutto, una Mini Mill Wiley è usato per macinare la ECM asciutto in una polvere finissima. Scegli la dimensione appropriata setaccio per i vostri scopi, qui, il 40 mesh calibro è utilizzato. Una volta che la maggioranza del campione è arrivato attraverso il filtro, rimuovere il vaso insieme con la polvere ECM fresato. Se c&#39;è solo un piccolo campione, il resto del campione può essere estratto dal mulino in una varietà di modi, qui, un Q-tip viene utilizzata per rimuovere l&#39;ECM bloccato dietro le pale fisse del mulino. </li><li> Verificare sempre che il mulino è pulito e privo di detriti. E &#39;anche importante assicurarsi che sia il mulino e il campione sono completamente asciutti; tutta l&#39;umidità residua farà sì che l&#39;ECM per aggregare e raggrupparsi insieme, evitando di fresatura di successo. L&#39;ECM può raccogliere l&#39;umidità dell&#39;aria e quindi dovrebbe andare direttamente dal liofilizzatore al mulino. </li></ol></li><li> Digestione <ol class="lroman"><li> Per formare l&#39;ECM iniettabili, la polvere viene digerito pepsina. Il seguente protocollo è stato modificato da Freyetes, et al. (2). </li><li> E &#39;importante mantenere come sterile un prodotto il più possibile, in quanto sarà iniettato in vivo e la contaminazione può causare complicazioni. Così, l&#39;uso fiale sterili e pesano cucchiai e filtrare tutte le soluzioni prima dell&#39;uso. Un passo dopo la liofilizzazione di fresatura e prima che la digestione aiuterà anche a mantenere la sterilità. </li><li> Pesare la quantità desiderata di polvere ECM in una fiala di scintillazione appropriato. Per i volumi totali inferiori a 1 ml, si consiglia di utilizzare un flaconcino da 2 ml e per grandi volumi, a 20 ml fiala. Questo assicura che ci sia abbastanza liquido sul fondo del flacone per mescolare in modo efficace. </li><li> Pesare la quantità desiderata di pepsina in una fiala di scintillazione. Aggiungere 0,1 M tale che la pepsina è ad una concentrazione di 1 mg / mL HCl. Assicurarsi che la pepsina è completamente sciolto (non particolato) prima di utilizzare questo può essere accelerato dalla vortex soluzione di pepsina. </li><li> Aggiungere la pepsina / HCl soluzione al flaconcino scintillazione con la polvere ECM in modo che l&#39;ECM è ad una concentrazione di 10 mg / ml. </li><li> Agitando la soluzione continuamente per 60-65 ore, periodicamente raschiare lungo i lati del flaconcino con un peso cucchiaio o una spatola. </li></ol></li><li> Regolazione del pH <ol class="lroman"><li> Questa operazione viene eseguita per portare il materiale liquido a matrice a pH fisiologico e per inattivare la pepsina, salvandola dalla fende la ECM ulteriormente. Anche in questo caso, assicurarsi di utilizzare soluzioni filtrata fatta con acqua Millipore. </li><li> 1 M NaOH è aggiunto da 1 / 10 del volume originale. Controllare periodicamente il pH a questo punto e aggiungere piccole quantità (2-10 mL) di NaOH o HCl tale che il pH desiderato (7.4) è raggiunto. Tenere traccia di tutti gli importi piccola aggiunta per la neutralizzazione o rimossi per il test del pH. Una volta che la soluzione è stata neutralizzata, aggiungere 10x PBS da 1 / 10 del volume finale (1 / 9 al volume corrente). Determinare la concentrazione della ECM iniettabili e quindi aggiungere 1x PBS raggiungere desiderato co finalencentration, qui 6 mg / mL. </li><li> Caratterizzazione della ECM iniettabili può essere fatto tramite SDS-PAGE, analisi GAG Blyscan colorimetrici, e la spettroscopia di massa. </li><li> A questo punto, il materiale della matrice può essere iniettato in vivo per formare un patibolo per l&#39;ingegneria tissutale del miocardio. </li></ol></li><li> Biotina-Etichettatura <ol class="lroman"><li> L&#39;ECM possono essere contrassegnate con biotina prima dell&#39;iniezione di facile visualizzazione della ECM iniettato. </li><li> Preparare una soluzione 10mM di biotina e aggiungere al ECM iniettabili con un rapporto di 0.3mg/mg. L&#39;ECM deve essere alla concentrazione desiderata per l&#39;iniezione. Se l&#39;iniezione ad una concentrazione di 6 mg / mL, aggiungere 40 microlitri biotina per 1 ml di ECM. Prima dell&#39;iniezione, mantenere la biotina-ECM soluzione in ghiaccio per almeno 1 ora. </li></ol></li><li> Tutte le fasi di lavorazione possono essere effettuate a temperatura ambiente. Per mantenere la matrice iniettabili di gelificazione, il passo regolazione del pH può essere fatto su ghiaccio. </li></ol> 3. Iniezioni miocardico <ol class="lalpha"><li> Iniezione di preparazione <ol class="lroman"><li> Per i ratti di sesso femminile (225-250 g), qui usato, 75 iniezioni ml di pH 7,4 iniettabili ECM sono stati preparati in 0,1 ml siringhe punta con 30 aghi di calibro. Se ratti maschi (375-400 g) sono stati utilizzati, 90 microlitri potrebbe essere iniettato. </li><li> Tutte le forniture chirurgici devono essere sterilizzati prima dell&#39;intervento chirurgico, qui usiamo un pacchetto di autoclave chirurgica che contiene tutti gli strumenti necessari. </li></ol></li><li> Il giorno della chirurgia, un Sprague-Dawley Harlan ratto è anestetizzato con isofluorano al 5%, intubato con un otoscopio, e poi mantenuto al 2,5% isoflurano tutta la procedura. </li><li> Aggiungi unguento artificiale lacrime agli occhi dell&#39;animale per la protezione contro l&#39;aridità e capelli. Somministrare 3 ml di soluzione Ringer lattato per l&#39;idratazione durante l&#39;intervento chirurgico. Questo dovrebbe essere fatto per via sottocutanea nella zona addominale inferiore. </li><li> Posto l&#39;animale in posizione supina sul tavolo operatorio e delicatamente il nastro in basso arti. Usa tagliaunghie per rimuovere i peli sull&#39;addome e capelli vuoto libero prima di lavaggio. </li><li> Effettuare una serie di iniezioni di piccole dimensioni (circa 50 microlitri ciascuno) del 2% lidocaina lungo una diagonale dal processo zyphoid per abbassare il lato destro dell&#39;addome. Poi macchia tre volte con Betadine, a partire dal centro e lo spostamento verso l&#39;esterno. Ripetere con etanolo al 70%. Coprire l&#39;animale con un drappo chirurgica con un pre-made finestra circolare; fissarlo con fascette asciugamano, se necessario. </li><li> Usando un bisturi n. 10 fanno un&#39;incisione 3-4 cm dal processo xifoideo per abbassare il lato destro dell&#39;addome. Individuare processo xifoideo e sezionare verticalmente verso il basso attraverso il muscolo a destra, facendo attenzione ad evitare la nave di grandi dimensioni sulla destra. Una volta sezionato attraverso il muscolo, usare le forbici per tagliare lateralmente attraverso il muscolo, esponendo il diaframma. Attenzione ad evitare il fegato. </li><li> Utilizzando una lunghezza di 36 pollici di 3-0 Vicrile sutura e un paio di hemostats, guidare un ago attraverso il processo zyphoid e tirare la sutura a metà. Nastro le estremità della sutura insieme e risolvere che ad un punto sopra e dietro l&#39;animale essenzialmente sollevando il zyphoid e di esporre il diaframma. Con un&#39;altra lunghezza di 36 pollici di 3-0 sutura Vicrile, guidare un ago attraverso il muscolo più vicina al processo xifoideo e, ancora, farcela e fissare le estremità di un altro punto alla destra del tavolo operatorio, esponendo completamente la cavità chirurgica. </li><li> A questo punto, dovreste essere in grado di vedere il cuore attraverso il diaframma. Usando un piccolo paio di microforceps dente topo, afferrare il centro del diaframma, tirarlo verso di sé e fare una piccola incisione con forbici. E &#39;estremamente importante usare le forbici molto brusco per evitare colpendo i polmoni. Una volta che questo buco è stato fatto, i polmoni si ritrae, consentendo di fare un&#39;incisione di 2-3 cm in verticale attraverso il diaframma per visualizzare il cuore. </li><li> Inserire un 3-pollici Q-tip a sinistra della cavità per spingere i polmoni fuori del modo. Utilizzare un morsetto per fissare il telo Q-tip sul posto. Utilizzare un altro Q-tip per spostare il polmone destro di mezzo al fine di individuare il pericardio. Usando un paio di microforceps e un paio di grandi pinze dentellate, strappo attraverso il pericardio, esponendo l&#39;apice del cuore. Se l&#39;animale ha già subito un infarto del procedimento, il pericardio sarà già assente. </li><li> Afferra l&#39;apice del cuore con microforceps denti il ​​ratto e iniettare il materiale liquidi a matrice attiva un terzo della salita dal vertice. Inserire l&#39;ago parallelo alla superficie epicardico e iniettare con il bordo smussato dell&#39;ago a sinistra. Essere sicuri di evitare la grande vena cardiaca. Aspetta un paio di secondi prima di rimuovere l&#39;ago. Si dovrebbe vedere un sbiancamento dei tessuti nel sito di iniezione. </li><li> Ripulire il sangue nella cavità e rimuovere la pinza asciugamano e Q-tip che teneva il polmone destro. Usa microhemostats curve e il topodente microforceps per chiudere il diaframma. Fai un nodo iniziale e poi usare il forcipe dentato e microhemostats di chiudere il diaframma con una sutura continua e un ago conico. Prima di chiudere del tutto, inserire PE160 tubo di aspirazione e utilizzare una siringa da 10 ml di evacuare la cavità toracica, come la sutura è serrato. </li><li> Se correttamente evacuato e chiuso, il diaframma dovrebbe essere concava. Un diaframma convessa indica che c&#39;è ancora aria nella cavità. </li><li> A questo punto l&#39;isoflurano può essere attivata fino a 1%. </li><li> Estrarre entrambi i 3-0 punti di sutura Vicrile tenendo la cavità aperta. Utilizzare acqua sterile per idratare il muscolo, spazzando via l&#39;eccesso con un cotton fioc o garze sterili. Utilizzare una nuova lunghezza di 3-0 sutura per chiudere la strato muscolare con suture intermittente. </li><li> A questo punto, l&#39;isoflurano può essere disattivata. </li><li> Pulire l&#39;area con acqua sterile e punti metallici utilizzare per chiudere la pelle. Se graffette interferirà con lo studio, 5-0 sutura prolina può anche essere usato. In questo caso, utilizzare una inversione di taglio (RC) l&#39;ago per chiudere la pelle con punti di sutura intermittente. In entrambi i casi, posto colla chirurgica sopra l&#39;incisione chiuso. </li><li> Utilizzare un Q-tip per ungere il sito di incisione con una tripla-pomata antibiotica. </li><li> Permettere agli animali di recuperare sotto ossigeno al 100%. </li><li> Quando gli animali comincia a respirare attorno al ventilatore, rimuovere il tubo tracheale. </li><li> Una volta che gli animali sono sternale, somministrare una iniezione sottocutanea di 0,05 mg / kg di buprenorfina cloridrato e restituirli alla loro gabbia casa su un telo sterile. </li><li> Gli animali devono ricevere post-operatorio di osservazione e cura. </li><li> Al momento i punti di interesse, gli animali sono eutanasia e il cuore rimosso per l&#39;analisi. Brevi sezioni trasversali all&#39;asse sono prese e possono essere colorati con ematossilina e eosina (H &amp; E) per l&#39;analisi dei tessuti lordo. A tempi brevi, la regione iniettato apparirà come una rosa, la rete fibrosa che si è diffusa interstizialmente. Nei punti secondo momento, si osserverà un afflusso di cellule e di un eventuale degrado della matrice iniettato dopo 2 o 3 settimane. Se l&#39;ECM è stato marcato con biotina prima dell&#39;iniezione, può essere più direttamente visibili con la colorazione della biotina con HRP-coniugato streptavidina. La colorazione immunoistochimica può essere utilizzato per identificare cellule specifiche o strutture nella regione di iniezione, qui le diapositive sono state co-tinto con un coniugato FITC isolectin che si lega alle cellule endoteliali e verde fluorescente e un anticorpo anti-actina del muscolo liscio con una secondaria Alexafluor anticorpo che segnala l&#39;SMC in rosso. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Caratterizzazione di materiali a matrice precedente preparati in questo modo ha dimostrato il mantenimento di una varietà di macromolecole. In particolare, proteine ​​fibrose multiple e glicoproteine ​​sono stati identificati tramite spettrometria di massa (Tabella 1). Se i materiali a matrice trattati in base a questo protocollo si riscontra la presenza non è più una complessa serie di macromolecole, potrebbe essere che il protocollo decellularization impiegata è troppo dura. Una volta completamente liofilizzati, secchi pericardico ECM assomiglia molto rigida, carta stropicciata. Altri tipi di tessuto somiglierà imballaggio arachidi. Se ben fresato, l&#39;ECM deve scendere attraverso il setaccio e da raccogliere nel vaso in basso. Se c&#39;è umidità sinistra nel campione, l&#39;ECM si aggregano insieme e rimane bloccata nella camera di macinazione. Dopo la digestione, la soluzione ECM dovrebbe essere un colore lattiginoso e completamente priva di particelle visibili. Sarà anche un po &#39;più viscoso rispetto alla sola HCl. Se l&#39;ECM non digerisce bene, ci saranno ancora le particelle di grandi dimensioni nel flacone, in alternativa, l&#39;ECM può bloccare dalla soluzione. Dopo la regolazione del pH, non c&#39;è alcun cambiamento visibile nella soluzione, e l&#39;ECM è ancora una nuvoloso, liquido omogeneo. Se inizia a gel, la viscosità aumenterà e sarà difficile o impossibile per disegnare il materiale in una siringa. Se ciò accade, eseguire il passaggio regolazione del pH su ghiaccio, con pre-raffreddata soluzioni. Una volta che le iniezioni sono state preparate, tenerli in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Se l&#39;iniezione viene eseguita correttamente, la regione attorno alla punta dell&#39;ago imbianca e un piccolo bolo è visibile. Se questo non viene rispettato, l&#39;iniezione può essere andato nella camera al posto di al muro. Quando l&#39;animale sutura dopo l&#39;iniezione, chiusura attenta del diaframma è il passo più importante. Se fatto correttamente, il diaframma sarà stretta contro i polmoni e apparirà concava. Se c&#39;è l&#39;aria sinistra all&#39;interno dei polmoni, il diaframma resterà convessa, o hanno una zona dove palloncini fuori. Nell&#39;esaminare l&#39;istologia della regione di iniezione in un punto temporale iniziale (30 minuti a 4 ore post-iniezione), si dovrebbe vedere una rosa, area fibrosa che è privo di cellule di questo è il materiale di matrice riassemblati post-iniezione (figura 2) . La rete si diffonde spesso interstizialmente e possono essere presenti molte sezioni in tutto. Un possspiegazione ne che dovrà vedere solo una piccola area di matrice gel è che una parte dell&#39;iniezione mancato l&#39;obiettivo ed è stato intramurale sia iniettato nella camera di LV o trapelato dal luogo di iniezione. Inoltre, a seconda del tempo di gelificazione, la diffusione interstiziale possono variare. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Poliacrilammide gel elettroforesi (PAGE) risultati. (A) standard di peso molecolare. (B) Rat collagene di tipo I coda (2,5 mg / mL) rispetto ai umano solubilizzato (C) e suina (D) pericardica ECM (7 mg / mL). Si noti la presenza di collagene così come diverse altre proteine ​​e peptidi in campioni di matrice pericardica. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109table1.jpg" alt="Tabella 1" /> Tabella 1. Componenti ECM identificato con la spettroscopia di massa. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 miocardica iniezioni. Gelificazione in vivo. H &amp; E macchia umana (A) e suina (B), iniezioni di matrice pericardico che hanno gelificato in vivo dopo 45 minuti. Le frecce indicano posizione matrice, macchiato leggero rosa rispetto al miocardio. Barra di scala è di 500 micron. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Infiltrazione delle cellule vascolari. Macchie fluorescenti per le navi nella umano iniettato (AC) e suina (DF) gel matrice a due settimane. Le cellule endoteliali sono etichettati verde (A, D), mentre le cellule muscolari lisce sono etichettati rosso (B, E). Immagini fuse sono mostrati in C e F. Scala bar è di 100 micron. Le linee bianche tratteggiate indicano l&#39;area di iniezione matrice, come determinato da H &amp; E l&#39;analisi di una sezione nelle vicinanze. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Cellule staminali nella regione di iniezione matrice. Un Hoescht macchia per nuclei (blu) e c-kit (verde) identifica le cellule staminali nell&#39;uomo (A) e suina (B) le regioni iniezione matrice. Barra di scala è di 50 micron.

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	<li>Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+an+injectable+pericardial+matrix+gel:+A+potentially+autologous+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Tissue Engineering. , (2009).</li><li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix.">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).</li><li>Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+decellularization+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+the+porcine+aortic+valve+leaflet.">Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet.</a> Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).</li><li>Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).</li><li>Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+fibrin+scaffold+improves+cell+transplant+survival,+reduces+infarct+expansion,+and+induces+neovasculature+formation+in+ischemic+myocardium.">Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium.</a> J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).</li><li>Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+alone+and+skeletal+myoblasts+in+a+fibrin+scaffold+preserve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction.</a> Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).</li><li>Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rodent+model+of+myocardial+infarction+for+testing+the+efficacy+of+cells+and+polymers+for+myocardial+reconstruction.">A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction.</a> Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).</li><li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14, 213-221 (2008).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material.">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li></ol>

Animale Usa: Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida pubblicate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la University of California, San Diego e l&#39;Associazione Americana per l&#39;accreditamento delle cure degli animali da laboratorio.

Questo metodo consente la generazione di derivazione biologica, scaffold iniettabili per l&#39;ingegneria tissutale del miocardio. Anche se questi metodi sono stati inizialmente sviluppati per la fabbricazione e la sperimentazione in vivo di un gel matrice del miocardio e presentato qui con un gel matrice pericardico, questo protocollo può essere adattato per essere utilizzato con qualsiasi tessuto, a condizione che il tessuto può essere opportunamente decellularized. Decellularization deve essere es...

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<td>Reagents:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pepsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>p6887-1G</td>
<td>Lyophilized </td>
</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>21217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutravidin-HRP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>21130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equipment: </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wiley Mini Mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>3383L10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Labconco Lyophilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labconco, Inc</td>
<td>7670520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical supplies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Purdue Products, L.P.</td>
<td>67618-154-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lactated Ringers Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>003966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KY Jelly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>28658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lidocaine, 2%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>17767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd.</td>
<td>12496-0757-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Artificial tear ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>NC9860843</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triple antibiotic ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>19082795</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>60307-120-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Otoscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>008699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stop cock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>006245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-0 Vicrile suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>J327H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-0 Proline suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>s-1173</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reverse cutting (RC) needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8684G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microhemostats </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>13013-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat tooth microforceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11084-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>No. 10 scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10110-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blunt scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14108-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sharp, curved scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14085-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Large, serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>1106-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE160 suction tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427430 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clippers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>21608</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Skin staples/stapler </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>PRR35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>General supplies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stir plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 M HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 M NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10x PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1x PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 mL syringes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mL syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Q-tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical drape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Towel clamps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small hand-held vacuum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of biologically derived injectable materials for myocardial tissue engineering

Questo protocollo fornisce i metodi per la preparazione di un iniettabile matrice extracellulare (ECM) gel per applicazioni di ingegneria dei tessuti del miocardio. In breve, il tessuto decellularized è liofilizzato, macinato, digerito enzimaticamente, e poi portato a pH fisiologico. La liofilizzazione elimina tutto il contenuto di acqua dal tessuto, con conseguente ECM secco che può essere macinato in una polvere fine con un piccolo mulino. Dopo la fresatura, la polvere ECM viene digerito con pepsina per formare una matrice iniettabile. Dopo aggiustamento a pH 7,4, il materiale della matrice liquido può essere iniettato nel miocardio. Risultati dei dosaggi caratterizzazione precedenti hanno dimostrato che i gel matrice prodotta dal tessuto miocardico decellularized pericardico e conservare i componenti nativi ECM, tra cui diverse proteine, peptidi e glicosaminoglicani. Dato l&#39;utilizzo di questo materiale per l&#39;ingegneria tissutale, caratterizzazione in vivo è particolarmente utile, qui, un metodo per eseguire una iniezione intramurale nel ventricolo sinistro (LV) parete libera è presentato come un mezzo per analizzare la risposta dell&#39;ospite al gel matrice un modello animale di piccole dimensioni. L&#39;accesso alla cavità toracica si ottiene attraverso il diaframma e l&#39;iniezione è fatta leggermente sopra l&#39;apice nel muro LV libero. La derivazione biologica impalcatura può essere visualizzata da biotina-etichettatura prima dell&#39;iniezione e poi colorazione sezioni di tessuto con un rafano perossidasi-coniugato neutravidin e la visualizzazione tramite diaminobenzidina (DAB) colorazione. Analisi della regione di iniezione può essere fatto anche con colorazione istologica ed immunoistochimica. In questo modo, i gel già esaminato matrice pericardio e del miocardio hanno dimostrato di forma fibrosa, reti poroso e promuovere la formazione di vasi all&#39;interno della regione di iniezione.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Metodi per la preparazione di un gel iniettabile matrice dal tessuto decellularized e iniettarlo nel ratto miocardio<em&gt; In vivo</em&gt; Sono descritti.

Fabbricazione di derivazione biologica Materiali iniettabili per l&#39;ingegneria tissutale miocardica

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Views.  University of California, San Diego. Metodi per la preparazione di un gel iniettabile matrice dal tessuto decellularized e iniettarlo nel ratto miocardio In vivo Sono descritti.

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Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l&#39;analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Ricerca

Bioingegneria

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l&#39;ingegneria tissutale

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Per la pelle Ingegneria dei Tessuti

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Fabbricazione di meccanicamente Tunable e Bioactive metallo Ponteggi per applicazioni biomediche

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

L&#39;isolamento di Murine adiposo derivate dal tessuto microvascolare Frammenti come vascolarizzazione Unità per Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Fabbricazione scalabile di Stretchable, Dual Channel, organo di Microfluidic chip

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...