Questa ricerca è stata finanziata dalla Scienze Naturali e ingegneria Research Council del Canada, Canadian Institute for Health Research e il Québec Research Center CHU de.

1. Realizzazione e montaggio del Static bioreattore <ol><li> Realizzazione della Riserva <ol><li> Preparare 50 ml provette da centrifuga da serbatoio per mezzo di coltura del bioreattore. </li><li> Fare due porte perforando due 5 mm Diametri fori a 20 mm dal fondo e la parte superiore del serbatoio, rispettivamente. Quindi inserire due raccordi luer in 5 millimetri tubi lunghezza di silicone. Press-Fit questi raccordi luer attraverso i fori, e sigillare tutte le connessioni con la colla silicone medicale. </li><li> Inserire un filtro nell&#39;attacco superiore del serbatoio (Figura 1A) 0,22 micron. </li><li> Inserire un setto luer nell&#39;attacco inferiore del serbatoio (Figura 1A). </li></ol></li><li> Assemblea Mandrino-cap <ol><li> Praticare un foro di diametro di 4,5 mm a centro del tappo ventilato del tubo serbatoio senza danneggiare la membrana del filtro che copre i fori di aerazione. </li><li> Preparare una ancoretta (diametro = 4.5 mm, lunghezza = 100 mm) Come un mandrino per il costrutto. </li><li> Preparare due tappi conici in silicone (lunghezza = 10 mm, con diametro medio foro = 4.5 mm). </li><li> Assemblare il mandrino ed il tappo (complesso mandrino-cap) come descritto nella Figura 1B. <ol><li> Press-montare il mandrino nel foro. Inserire i 2 tappi sul mandrino in modo che il tappo è montato tra loro. Regolare la posizione del mandrino in modo che la sua lunghezza utile è di 78 mm. </li><li> Applicare un primer e poi colla silicone di grado medico alle superfici che saranno in contatto prima di unirsi al tappo e tappi conici in silicone insieme. Rimuovere la colla in eccesso sul tappo. </li></ol></li><li> Lasciare asciugare a temperatura ambiente per 1-3 giorni. </li></ol></li><li> Realizzazione della garza-grip <ol><li> Preparare 3 tubi silicone (tubo 1: diametro interno = 6,4 millimetri, lunghezza = 5 millimetri; tubo 2: diametro = 6,4 millimetri, lunghezza 10 mm, e tubo 3: diametro = 3,1 millimetri, lunghezza = 12 mm). </li><li> Assemblare i garza-grip come descrittod nella Figura 1C. <ol><li> Taglio tubo 1 longitudinalmente, e aprirlo su tubo 2. Bastone insieme con la colla siliconica. </li><li> Tagliare garza sterile chirurgica al 5 cm x 7 cm foglio, e poi rotolare ermeticamente la garza sul tubo 3 lungo il lato più lungo della garza. Inserire il tubo complesso 1-tubo 2 sopra la garza. </li><li> Aggiungere colla siliconica attaccare insieme la garza, il complesso tubo 1-tubo 2 e il tubo 3. Tagliare la garza ad una lunghezza di 8 mm. </li></ol></li></ol></li><li> Assemblaggio e sterilizzazione <ol><li> Montare il complesso mandrino-cap e la garza-grip come descritto nella Figura 2. <ol><li> Rivestire il mandrino con grasso grado medico (Figura 2A). Posizionare la garza-grip sul mandrino (Figura 2B). Distanza le impugnature al valore fisso di 35 mm l&#39;uno dall&#39;altro. </li><li> Preparare uno stampo tubolare rimuovendo la parte inferiore di una siringa da 10 ml usando una sega circolare (finale Lunghezza = 8 mm) ( <strong&gt; Figura 2B). </li></ol></li><li> Inserire lo stampo sul gruppo mandrino-cap garza impugnature attrezzato (complesso residenziale-stampo), lo snap-montaggio lo stampo sul tappo in silicone (Figura 2C). </li><li> Autoclave il serbatoio e il complesso residenziale-muffa. Nota: Fare attenzione a tenere il tappo in silicone saldamente quando si inserisce lo stampo per evitare il suo distacco. </li></ol></li></ol> 2. Ingegneria muscolatura liscia cellule costrutti basati su gel di collagene e Static Maturazione <ol><li> Ingegneria costrutti <ol><li> Expand suina aortica cellule muscolari lisce (pSMCs) in 175 cm 2 fiasche di coltura riempito con 20 ml di mezzo di coltura completo composto da Dulbecco Modified Eagle Medium supplementato con 10% (v / v) di siero di suini (PS), 10% (v / v ) di siero fetale bovino (FBS), 1% (v / v) di penicillina-streptomicina (pen-strep). </li><li> A ≈90% confluenza, staccare pSMCs (passaggio 2-4) rimuovendo il terreno di coltura dellapallone di pSMCs, aggiungendo 5 ml di soluzione di tripsina (1x in soluzione salina tamponata con fosfato, PBS), e incubando per 10 min (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità). </li><li> Risospendere le pSMCs ad una concentrazione di 4 x 10 6 cellule / ml in mezzo di coltura completo. </li><li> Preparare la soluzione di collagene come descritto in precedenza 10. <ol><li> Estrarre e raccogliere fasci di collagene da tendini coda di topo in una soluzione PBS. </li><li> Trasferire le fibre di collagene successivamente in acetone (5 min), isopropanolo al 70% (v / v) (5 min) e acido acetico (0,02 N, 48 hr, 4 ° C) soluzioni. </li><li> Miscela la soluzione viscosa e congelare a -20 ° C per 3 giorni. </li><li> Lyophilize la soluzione congelata per ottenere spugne di collagene. </li><li> Solubilizzare le spugne di collagene in soluzione di acido acetico (0,02 N) ad una concentrazione di 4 g / L e centrifugare a 29.581 g vigore per 45 min. </li><li> Sterilizzare la soluzione di collagene attraverso il processo di dialisi contro successive solutions di acido acetico (0,02 N, 1 ora), cloroformio 1% (v / v, 1 ora) e acido acetico (0,02 N, soluzione sterile cambiata ogni 2 giorni per 1 settimana). </li><li> Raccogliere la soluzione di collagene sterile (4 g / L) in una cappa sterile coltura cellulare. </li></ol></li><li> Preparare gel di collagene cellularized come mostrato in figura 3. <ol><li> Preparare 50 ml di soluzione tampone sterile miscelando 35 ml di DMEM (5x), 4 ml di HEPES (1 N), 3 ml di NaOH (1 N) in 8 ml di acqua deionizzata sterile. </li><li> Preparare cellule e la miscela di gel di collagene in un contenitore posto in ghiaccio mescolando 50% (v / v) di soluzione di collagene sterile (4 g / L di acido acetico 0,02 N) con il 25% (v / v) di soluzione tampone e il 25% (v / v) della sospensione di pSMCs in mezzo di coltura completo. </li></ol></li><li> Misurare il pH della miscela e accertarsi che sia compreso tra 7,0 e 7,4. </li><li> Versate delicatamente 9 ml di miscela di cellule-e-collagene nel complesso di cui sopra abitazioni / muffa (passo 1.4.3, figura 3A-B </strong&gt;). </li><li> Lasciare gel a temperatura ambiente per 1 ora sotto il cofano coltura cellulare (Figura 3B). </li></ol></li><li> Maturazione in Static bioreattore <ol><li> Rimuovere lo stampo (Figura 3C) e trasferire accuratamente il costrutto nel serbatoio, contenente 35 ml di terreno di coltura (Figura 3D). </li><li> Incubare il costrutto (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità) in posizione verticale per 1 o 2 settimane di maturazione statica. </li><li> Installare una telecamera web (sigillato per garantire l&#39;isolamento) all&#39;interno dell&#39;incubatrice davanti costrutto. </li><li> Modificare il terreno di coltura ogni 2 giorni aspirando il vecchio mezzo dalla porta luer setto e ri-riempire il serbatoio con una quantità equivalente di terreno di coltura fresco. </li></ol></li><li> Misurazione dello spessore e metabolica attività di SMC-collagene Gel a base di costrutti Durante Cultura Static <ol><li> Posizionare l&#39;interferometro laser a scansione nella cultu cellulareri cappuccio e capovolgere dalla verticale alla posizione orizzontale con una livella. </li><li> Trasferire il bioreattore nella cappa coltura cellulare e rimuovere il costrutto dal serbatoio. </li><li> Trasferire il costrutto (ancora montato sul mandrino) nel percorso del raggio laser, e posizionarlo strettamente ortogonalmente rispetto all&#39;asse del fascio (come mostrato nella Figura 4). </li><li> Leggere il valore visualizzato sullo schermo del laser interferometro scansione, corrispondente al diametro esterno del costrutto. </li><li> Calcolare lo spessore della parete del costrutto base al suo diametro esterno ed interno (cioè il diametro del mandrino). Nota: ripetere i passi 2.3.1 a 2.3.5 ogni ora per la prima 12 ore e poi ogni 24 ore. </li><li> Usare 1 ml del vecchio terreno di coltura (campionata quando si cambia il terreno di coltura, passo 2.2.4) per misurare le concentrazioni di lattato e glucosio con l&#39;analizzatore di gas nel sangue. </li><li> Usare 1 ml diterreno di coltura fresco come un livello base per le misure delle concentrazioni di glucosio e lattato 14. Nota: ripetere i passi 2.3.6 e 2.3.7 ogni 2 giorni dopo terreno di coltura che cambia. </li></ol></li><li> Costruire raccolta per ulteriori Ccharacterizations meccanica e biologica <ol><li> Dopo 1 o 2 settimane di stagionatura statica, trasferire il bioreattore statica nel cofano coltura cellulare. </li><li> Trasferire delicatamente il costrutto maturo dal suo mandrino (supplementare Video 1) ad una piastra di Petri da 100 mm contenenti 40 ml di terreno di coltura fresco (Figura 5 e Figura 7A). </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione meccanica dei costrutti del longitudinali e circolari arrivarci <ol><li> Installare il set-up sperimentale costituito dal tester micromeccanica dotato di una cella di 5 o 10 N carico ed un bagno contenente PBS a 37 ° C per mantenere i campioni at condizioni pseudo-fisiologico (Figura 6). </li><li> Bilanciare la cella di carico e dell&#39;estensimetro. Nota: Balancing è una funzione integrata nel tester micromeccanica consiste nel ripristinare il valore di estensione visualizzato e il valore di carico visualizzato mentre nessun campione è montato sulla macchina. Questa funzione permette di definire il riferimento per entrambe le misure. </li><li> Montaggio dei costrutti tubolari sul dispositivo meccanico: direzione longitudinale. Nota: eseguire prove di fatica longitudinali direttamente sull&#39;intero costrutti tubolari. Uso interno incorporato dispositivi di presa per collegare le prese garza dei costrutti alla cella di carico e alla base della vasca PBS. <ol><li> Montare il tubolare costruire sui dispositivi di presa (Figura 7B), seguendo la procedura di raccolta (punto 2.4). </li><li> Avvolgere i dispositivi di presa e le impugnature garza insieme con nastro di teflon per evitare lo slittamento delle impugnature garza durante la prova.Montare il campione attraverso il tester micromeccanica (Figura 7C). </li></ol></li><li> Montaggio dei costrutti ad anello sul dispositivo meccanico: direzione circonferenziale. Nota: eseguire prove di fatica circonferenziali su provini a forma di anello sezionati dai costrutti tubolari. Utilizzare due barre di acciaio inossidabile come grip per fissare i campioni. <ol><li> Montare il tubolare costruire su un tubo di plastica come supporto contrassegnato con 5 lacune mm (Figura 7B), a seguito della raccolta (punto 2.4). </li><li> Tagliare 10 millimetri anelli dal costrutto tubolare. </li><li> Misurare la lunghezza del campione utilizzando un calibro a corsoio per le ulteriori analisi. </li><li> Montare il campione a forma di anello sulle barre di acciaio inossidabile del tester micromeccanica (Figura 7C). Assicurarsi di posizionare il campione al centro delle barre. Nota: Il tubo di plastica nel passo 3.4.1 e un sistema di taglio, come mostrato nella Figura 7B </strong&gt; vengono utilizzati per evitare danni al costrutto durante il taglio. </li></ol></li><li> Prova di fatica sul costrutti in senso longitudinale o circonferenziale. <ol><li> Allungare il costrutto alla sua lunghezza calibro iniziale. </li><li> Mantenere il costrutto in questa posizione per 10 min in un ambiente pseudo-fisiologico. </li><li> Applicare il 10% di deformazione ciclica della lunghezza del calibro iniziale (30 cicli) per la costruzione di 5% / sec velocità di deformazione. </li><li> Ripetere il punto 3.5.3 a passi incrementali di 10% di deformazione ciclica fino alla rottura del campione. Nota: L&#39;uso dell&#39;ambiente pseudo-fisiologico richiede tenendo conto della galleggiabilità e l&#39;inerzia del sistema di presa che influenzano la misura del carico applicato. </li><li> Registrare il fondo come segue: <ol><li> Spostare il telaio di carico per il tratto utile iniziale. </li><li> Ripetere la procedura 3.5.3 e 3.5.4 senza montato qualsiasi campione, e mantenendo i dispositivi di presa collegati alla cella di carico (solo 1 ciclo è requirosso). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Luminal endotelizzazione di costrutti Nota: Dopo aver seguito il protocollo di raccolta (punto 2.4), i costrutti resistono gestione per essere montato nel bioreattore rotante a parete per l&#39;ulteriore endotelizzazione. <ol><li> Rotazione a parete Bioreattore design <ol><li> Praticare un foro di diametro di 4,5 mm a centro del tappo ventilato del tubo serbatoio senza danneggiare la membrana del filtro che copre i fori di aerazione. </li><li> Press-montare un mandrino (diametro = 4.5 mm, lunghezza = 40 mm) nel foro e fissare il mandrino come descritto al punto 1.1.2. </li><li> Preparare due supporto in silicone a forma di C per il diametro esterno costrutto = 14 millimetri; diametro interno = 8 mm). </li><li> Posizionare un motore in rotazione in una estremità del bioreattore rotante parete e un cuscinetto sull&#39;altra estremità (Figura 8B). </li></ol></li><li> Lumen endotelizzazione <ol><li> Espandere umbilic umanoal vena cellule endoteliali (HUVEC) in 25 cm 2 fiasche di coltura con 5 ml di mezzo di coltura M199 supplementato con 10% (v / v) PS, 10% (v / v) FBS, 1% (v / v) pen-strep in piastra di Petri all&#39;interno di un incubatore (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità) fino al 90% di confluenza. </li><li> Preparare 1,5 ml della soluzione di rivestimento proteine ​​al costrutto richiesto per l&#39;adesione cellulare ottimale diluendo la miscela di concentrato di proteine ​​a 10,5 ng / ml in endoteliale mezzo privo di siero coltura cellulare. </li><li> Misurare la lunghezza del costrutto utilizzando un calibro a corsoio. </li><li> Calcolare il volume luminale V e l&#39;area luminale A del costrutto come: V = D in 2 L / 4 e A = D a L, rispettivamente (dove D è il diametro interno corrispondente al diametro del mandrino, e L è la lunghezza del costrutto). </li><li> Posizionare il costrutto al centro del serbatoio seguendo la procedura di raccolta (sezione 2.4).Utilizzare il supporto in silicone a forma di C per fissare il costrutto a entrambe le estremità per il serbatoio (Figura 8A). </li><li> Riempire il serbatoio con 35 ml di terreno di coltura. </li><li> Riempire il 75% del volume calcolato luminale del costrutto (V) con la soluzione di rivestimento proteico preparato al punto 4.2.2. Chiudere entrambe le estremità del costrutto di evitare qualsiasi fuoriuscita della soluzione di rivestimento proteico (Figura 8A). </li><li> Montare il sistema di bioreattore rotante a parete all&#39;interno della cappa di coltura cellulare. </li><li> Posizionare il bioreattore a 37 ° C incubatore e avviare la rotazione del bioreattore a 4,02 x 10 -5 g forza per 1 ora per permettere il rivestimento luminale come mostrato in Figura 8B. </li><li> Aprire l&#39;estremità superiore del costrutto e aspirare la soluzione di rivestimento di proteine ​​dal lume. </li><li> Staccare HUVEC (passaggio 2-3) rimuovendo il terreno di coltura dal pallone di HUVEC e aggiungendo 3 ml della soluzione di tripsina (1x in PBS). IOncubate per 5 min (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità). </li><li> Risospendere le HUVEC ad una concentrazione di 4 x 10 6 cellule / ml in mezzo di coltura M199 integrato. </li><li> All&#39;interno del cofano coltura cellulare, sementi HUVEC nel lume del costrutto con una densità di 1.000 cellule / cm 2 15. Chiudere le estremità superiori del costrutto di evitare qualsiasi dispersione di soluzione HUVEC. </li><li> Incubare i costrutti (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità) ospitato nel bioreattore rotante parete (Figura 8B) e cultura per 2 giorni ad una rotazione costante di 4,02 x 10 -5 g forza. </li><li> Raccolto il costrutto dopo 2 giorni di coltura in condizioni sterili e prepararlo per l&#39;ulteriore caratterizzazione biologica come descritto nella sezione 2.4. </li></ol></li></ol>

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Nessun finanziamento è stato ricevuto da organizzazioni o agenzie con potenziale conflitto di interessi.

Tra la comunità di ingegneri dei tessuti vascolari, enormi sforzi sono stati fatti per riprodurre lo strato tunica media responsabili per la stabilità meccanica dei vasi sanguigni 16. Dal momento che il lavoro pionieristico di Weinberg e Bell 17, il collagene è stato ampiamente utilizzato come impalcatura per l&#39;ingegneria tissutale vascolare a causa della sua biocompatibilità, le proprietà non immunogeniche e disponibilità. Tuttavia, l&#39;uso di collagene rappresenta una sfida per i ricercatori, in quanto questo materiale non è facile da maneggiare, a causa della intrinseca mancanza di rigidità meccanica. Manipolazioni durante la preparazione patibolo possono danneggiare i ponteggi, li compromettendo per un ulteriore uso. La tecnica descritta in questo lavoro permette di: i) ingegnere gel di collagene cellularized in una geometria a forma tubolare; ii) per ingegnerizzare tessuti biologici abbastanza forte per essere gestita dopo un breve periodo di maturazione statica (1 o 2 settimane); iii) comesess proprietà meccaniche e viscoelastiche tali tessuti biologici a forma tubolare in 2 direzioni. Le cellule in gel svolgono un ruolo chiave nel rimodellamento della matrice di collagene. Durante il periodo di maturazione, SMCs contrattili portato alla compattazione dei gel che producono un costrutto con maggiore stabilità meccanica valutabili nelle direzioni longitudinali e circolari. In seguito, HUVECs testa di serie nel lato luminale dei costrutti generato un endotelio omogeneo e vitale, dimostrando così l&#39;idoneità dei gel di collagene per le applicazioni di ingegneria dei tessuti vascolari. Il bioreattore presentata in questo lavoro è stato progettato specificamente per fornire un ambiente ottimale per la crescita cellulare durante la maturazione statica. Inoltre, i dispositivi sviluppati per la caratterizzazione delle proprietà meccaniche e viscoelastiche dei costrutti sono stati progettati con lo scopo di ridurre i danni potenziali inerenti alla manipolazione ditali materiali delicati. Quindi, il bioreattore statica era dotato di un filtro di 0,22 micron e una membrana filtrante sul tappo (passaggio 1.1.2, figura 1A e B) che ha permesso lo scambio di gas tra terreno di coltura all&#39;interno del serbatoio e l&#39;incubatore, mantenendo un ambiente coltura sterile. Il setto luer sul fondo è stato utilizzato come porta per mezzo di coltura campionamento e cambiando durante la coltura statica. Alcuni passaggi critici devono essere considerati durante costrutto fabbricazione e caratterizzazioni. Tutte le manipolazioni (effettuate nella fase 2.1.1 e nelle fasi successive) che potrebbero alterare la sterilità del sistema sono state eseguite in una cappa biologica sterile. Cellule e gel di collagene preparazione della miscela è stata gestita in ghiaccio, al fine di ritardare il processo di gelificazione (passi 2.1.4 a 2.1.7). Al passo 2.1.7, eventuali bolle d&#39;aria intrappolate nella miscela prima della gelificazione sono potenziali zone di concentrazione delle tensioni che possono compromettere le sredditività dei costrutti. Pertanto, la rimozione di tali bolle d&#39;aria richiede un po &#39;tremante il montaggio o usando il vuoto medico per 3 minuti per degasaggio in condizioni sterili. Infine, le impugnature sono stati specificamente progettati per mantenere l&#39;asse del mandrino centrale nello stampo tubolare durante gelificazione e per consentire delicata manipolazione dei costrutti durante la raccolta (rimozione del mandrino, sezione 2.4), per endotelizzazione, e per facilitare il montaggio su il sistema meccanico (test longitudinali). Il presente protocollo propone un approccio originale di facile procedimento alternativo di rinforzo di gel di collagene costrutti basato sul naturale potenziale contrattile intrinseca SMCs. Tecniche comuni di matrici di collagene rinforzo implicano l&#39;uso di agenti fisici e chimici reticolanti che possono avere effetti deleteri sulle interazioni cellule-matrice 18 - 20. La tecnica di fabbricazione presentato inquesto lavoro permette di dirigere questo processo di rimodellamento cellule-driven per dare un costrutto tissutale con mirati proprietà meccaniche senza alcun trattamento fisico o chimico. Caratterizzazione delle proprietà meccaniche e viscoelastiche del gel di collagene idratati è una grande sfida. In questa prospettiva, il presente protocollo descrive un metodo originale semplice ed efficiente per valutare le proprietà meccaniche dei tessuti molli tubolari. Questa caratterizzazione può essere eseguita non solo in direzione circonferenziale, ma anche in senso longitudinale, direttamente su tutta la struttura tubolare. Durante caratterizzazione meccanica, temperatura, ambiente acquoso, pH e forza ionica sono alcuni dei fattori ambientali che sono noti per influenzare drasticamente il comportamento meccanico di tessuti biologici 21. Pertanto, il presente lavoro suggerisce un set-up e protocollo originale per la caratterizzazione meccanica dei tessuti biologici in un altamenteriproducibile pseudo-fisiologica ambiente (soluzione salina a 37 ° C e pH 7,4). Per quanto a nostra conoscenza, questo tipo di caratterizzazione non è mai stata riportata altrove. In conclusione, la tecnica proposta in questo lavoro dimostra l&#39;elevato potenziale di miscelazione diretta di cellule con collagene per applicazioni di ingegneria tissutale vascolari. Questo metodo insieme al processo di caratterizzazione e endothelialization meccanica costituiscono alti protocolli polivalenti. Quindi, attraverso piccole modificazioni del set-up e protocolli mantenendo la stessa logica, requisiti principali per l&#39;ingegneria dei tessuti vascolari equivalenti possono essere affrontati quali trattamento rapido e semplice, compresi endotelizzazione, e la possibilità di essere trasposta ad una vasta gamma di molle tessuti con diverse lunghezze e diametri. Inoltre, diversi tipi di cellule aderenti, proteine ​​ECM e geometrie stampati possono essere indagati per una serie di appli mirations, come i tendini ingegneria, innesti cutanei, patch cardiaci, nervi, tra gli altri. Sebbene le proprietà meccaniche dei costrutti sono incoraggianti, sono ancora inferiori a quelli dei tessuti nativi. In questo contesto, crediamo fortemente che un brevissimo periodo di maturazione statico è un passo cruciale verso la stimolazione dinamica in un bioreattore, determinando in tal modo una maggiore integrità strutturale e la stabilità meccanica. Tuttavia, la possibilità di produrre rapidamente cellularized costrutti a base di collagene tissutale adatto per meccanica ed istologica analisi rende il bioreattore statica qui descritto uno strumento utile e promettente per fornire una conoscenza l&#39;interazione tra cellule e ECM durante la crescita e il rimodellamento, o anche per essere utilizzato come modello per terapie e sistemi di drug delivery.

Ingegneria dei tessuti vascolari prevede diverse strategie mirate alla realizzazione di vasi ingegnerizzati, tra cui gli innesti a base di ponteggi sintetiche, vasi sanguigni tissutale basati strato di cellule (TEBVs) e matrice extracellulare (ECM) componenti basati TEBVs. Tra questi approcci, polimeri sintetici presentano buone proprietà meccaniche, ma condividono un inconveniente comune in quanto mancano bioattività 1. Il metodo basato su strato cellulare permette la produzione di sostituti vascolari artificiali, con elevate caratteristiche meccaniche, ma il tempo richiesto per produrre tali innesti è circa 28 settimane 2. Biopolimeri naturali della ECM, come il collagene, elastina, la fibrina 3 o una combinazione di questi, restano i materiali standard d&#39;oro per ponteggi di ingegneria tissutale. Questo è principalmente per la ragione che questi materiali possiedono generalmente buona biocompatibilità pur essendo in grado di indurre risposte cellulari funzionali 4-5. Tra questi biopolimeros, collagene di tipo I è uno dei più abbondanti e predominante proteina portante della ECM in molti tessuti come la pelle, vasi sanguigni e tendini. Un&#39;ampia attività è stata condotta sulle proprietà meccaniche del collagene 6 - 8, ma ci sono stati pochi studi sul rimodellamento cellulare del gel di collagene durante la maturazione statica. Rimodellamento cellulare si riferisce alle modifiche strutturali della matrice di collagene indotta da cellule che potrebbero alterare la stabilità della rete di fibrille di collagene 9. Come un ponteggio naturale, relativamente grandi quantità di collagene di tipo I possono essere isolate, sterilizzati e conservati da diverse fonti, come ratto-coda tendini 10. La comprensione interazioni cellulari con collagene e relativi comportamenti complessivi meccaniche degli scaffold di collagene cellularized (costrutti) è un passo essenziale per la costruzione di tessuti. TEBVs base di collagene possono essere elaborati miscelando direttamente le cellule con collagenedurante la preparazione del gel e ulteriormente modellato in forme particolari quali tubolare e planare 11. Cellule vascolari all&#39;interno dei gel proliferano e tipo rimodellare collagene 12. Così, questo metodo ignora la necessità di macroporosità specifica che rappresenta uno dei problemi significativi nello sviluppo di scaffold per applicazioni di ingegneria tissutale. Tuttavia, i principali svantaggi di gel di collagene sono le loro scarse proprietà meccaniche rispetto ai materiali sintetici 13. In questo studio, un tessuto vitale con distribuzione omogenea di cellule è stato progettato per miscelazione diretta di collagene con cellule in un unico passaggio. &quot;bioreattori statici&quot; sono stati utilizzati per le 1 o 2 settimane di maturazione statica dei gel di collagene cellularized (senza applicati vincoli meccanici dinamiche esterne). Durante la coltura, rimodellamento della matrice di collagene è verificato, fornendo così rinforzo strutturale per i costrutti. Inoltre, questi costrutti furono ready da trasferire ad un bioreattore rotante parete e un endotelio omogeneo è stato raggiunto. Inoltre, in questo lavoro viene proposto anche uno specifico protocollo di test meccanico per fornire un approccio adeguato nel caratterizzare le proprietà meccaniche dei tessuti molli tubolari. In sintesi, questo lavoro presenta un metodo per la rapida realizzazione e maturazione dei tessuti vascolari che sono abbastanza forti da trattare non solo per caratterizzazioni biologiche e meccaniche, ma anche per un ulteriore condizionamento meccanico in un bioreattore dinamico, che è considerato un cruciale in vitro intervenire la rigenerazione dei tessuti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229-475</td>
			<td>Centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male luer with lock ring x 1/8&#34; hose barb. PP. 25/pk</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-45503-04</td>
			<td>Luer fittings for &#34;gas-exchange port&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer x 1/8&#34; hose barb adapter. PP. 25/pk</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-45500-04</td>
			<td>Luer fittings for the &#34;medium sampling port&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft.</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96410-17</td>
			<td>Tube 1 and 2 for the gauze grippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft.</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td>Tube 3 for the gauze grippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic Medical adhesive silicone, type A</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>-</td>
			<td>Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvent 4 Vessel venting filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6713-0425</td>
			<td>Filter for &#34;gas exchange port&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod. PP. stirring. 8&#8217;&#8217;</td>
			<td>Scienceware</td>
			<td>377660008</td>
			<td>Mandrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopper silicone rubber 00 PK12</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59590-084</td>
			<td>Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krytox PFPE/PTFE Greases</td>
			<td>Dupont</td>
			<td>GPL 202</td>
			<td>Medical grade grease for covering the mandrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xiameter RTV-4130-J base and curing agent</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>-</td>
			<td>C-shaped silicone support for endothelialization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco (Life Technology)</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure acetone (99%)</td>
			<td>Laboratoire Mat Inc.</td>
			<td>AP0102</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC610080040</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific,&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FL070494</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform solution (99%)&#160;</td>
			<td>Laboratoire Mat Inc.</td>
			<td>CR 0179</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163716</td>
			<td>Chemical for construct preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Laboratoire Mat Inc.</td>
			<td>SR-0169</td>
			<td>Chemical for construct preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaserMike 136</td>
			<td>LaserMike</td>
			<td>Series 183B</td>
			<td>Scanning laser interferometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroPulse MicroTester</td>
			<td>Instron Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>Micromechanical Tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Media M199/EBSS, 500 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30253.01</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum HI - 500mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH 30396.03</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum (PS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9783</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP661-50</td>
			<td>Saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red</td>
			<td>Sarstedt Inc.</td>
			<td>83.1812.002</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0)</td>
			<td>EMD</td>
			<td>9583</td>
			<td>pH measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial&#160;</td>
			<td>BD Biosciences - Discovery Labware</td>
			<td>356230</td>
			<td>Concentrate protein mixture for endothelialization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeCam VX-3000</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Thickness measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical analyzer, DxC600</td>
			<td>Beckman Coulter Unicell Synchron</td>
			<td>-</td>
			<td>Glucose and lactate concentrations measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen fibers</td>
			<td>Rat tails</td>
			<td>-</td>
			<td>Collagen was extracted in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine smooth muscle cells (pSMCs)</td>
			<td>Porcine aortas</td>
			<td>-</td>
			<td>pSMCs were isolated in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Human umbilical veins</td>
			<td>-</td>
			<td>HUVECs were isolated in the laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering 3d cellularized collagen gels for vascular tissue regeneration

I materiali sintetici sono noti per avviare complicazioni cliniche come l&#39;infiammazione, la stenosi, e le infezioni quando impiantati come sostituti vascolari. Il collagene è stato ampiamente utilizzato per una vasta gamma di applicazioni biomediche e viene considerata una valida alternativa ai materiali sintetici per la sua biocompatibilità intrinseca (cioè, bassa antigenicità, infiammazione, e risposte citotossiche). Tuttavia, le limitate proprietà meccaniche e la relativa mano bassa-capacità di gel di collagene hanno ostacolato il loro uso come materiali scaffold per l&#39;ingegneria tissutale vascolare. Pertanto, la logica alla base di questo lavoro è stata la prima a progettare gel di collagene cellularized in una geometria a forma tubolare e in secondo luogo favorirne cellule muscolari lisce riorganizzazione guidato di matrice di collagene per ottenere tessuti abbastanza rigide da trattare. La strategia qui descritta si basa sul montaggio diretto di collagene e cellule muscolari lisce (costruire) in un cyli 3Dgeometria ndrical con l&#39;uso di una tecnica di stampaggio. Questo processo richiede un periodo di maturazione, durante il quale i costrutti sono coltivate in un bioreattore in condizioni statiche (senza applicati vincoli meccanici dinamiche esterne) per 1 o 2 settimane. Il &quot;bioreattore statico&quot; fornisce un ambiente sterile monitorati e controllati (pH, temperatura, scambio di gas, rifornimento dei nutrienti e rimozione dei rifiuti) per i costrutti. Durante il periodo di coltura, misure di spessore sono stati eseguiti per valutare l&#39;cellule-driven rimodellamento della matrice di collagene, e consumo di glucosio e tassi di produzione di lattato sono stati misurati per monitorare le cellule attività metabolica. Infine, le proprietà meccaniche e viscoelastiche sono stati valutati per i risultanti costrutti tubolari. A tal fine, i protocolli specifici e un know-how concentrato (manipolazione, di presa, lavorando in ambiente idratato, e così via) sono stati sviluppati per caratterizzare i tessuti ingegnerizzati.

Questo lavoro descrive la fabbricazione di costrutti a base di collagene tubolari ingegnerizzati contenenti cellule vascolari. Già dopo 1 ora di inizio di gelificazione, miscela cellule e collagene era direttamente assemblato in una geometria tubolare 3D, con il diametro esterno uguale al diametro dello stampo corrispondente (circa 14 mm). Lungo la maturazione statico, misurazioni hanno evidenziato la rapida riduzione del diametro esterno delle strutture cellularized tubolari, come mostrato in Tabella 1. Il diametro dei gel di collagene cellularized rimpiccioliti di circa il 60% del suo valore iniziale dopo 1 giorno di coltura statica, e di quasi il 85% entro 7 giorni (Supplemental Video 2). SMC all&#39;interno dei costrutti sono responsabili della contrazione osservata e il rinforzo meccanico correlati, in quanto questo fenomeno non si verifica in scaffold di collagene non cellularized. Da notare che è stata applicata nessuna sfumatura di qualsiasi tipo (termici, biochimici, meccanici, o altro). Le cellule-driven compattazione portato in un materiale con una maggiore densità di collagene che può essere maneggiato e sottomesso alle sollecitazioni meccaniche (Video aggiuntive 3 e 4). Per correlare il rimodellamento cellule-driven alle proprietà meccaniche e viscoelastiche generali, prove di fatica sono state eseguite su costrutti (video integrativi 5 e 6). Questi test consisteva nel ciclismo costrutti (30 volte) a diversi ceppi costanti (10%, 20% e 30% della lunghezza del calibro iniziale) e registrare lo stress come la risposta dei costrutti della sollecitazione meccanica nel tempo. I risultati rappresentativi per un costrutto sono mostrati in figura 9. Il costrutto resistito maggiori sollecitazioni nella direzione longitudinale (75 kPa) rispetto alla direzione circonferenziale (16 kPa) quando sono sottoposti alla stessa gamma ceppo (30% di deformazione). Nel frattempo, ad ogni ciclo, il valore di picco di stress raggiunto per la tadeformazione massima rgeted diminuito nel corso del tempo. Questo comportamento è tipico delle alte proprietà viscoelastiche presentati da questi costrutti base di collagene. L&#39;attività biologica dei costrutti cellularized stata valutata durante la maturazione statica. Quindi, l&#39;attività metabolica delle SMC è stata valutata misurando il consumo di glucosio e la produzione di lattato durante la coltura statica. Il terreno di coltura è stata campionata ogni 2 giorni e glucosio e concentrazioni di lattato sono state misurate usando un analizzatore di gas ematici. La costante incremento del consumo di glucosio e la produzione di lattato combinati per l&#39;importante contrazione dei costrutti, attestano l&#39;attività SMCs lungo coltura statica (Figura 10). La maggiore stabilità meccanica dovuta al rimodellamento cell-driven consentito la manipolazione dei costrutti e il successivo processo di endotelizzazione. Colorazione tricromica di Masson eseguita sui costrutti endotelizzazionemostrato un endotelio altamente omogenea. SMCs esibito una morfologia fusiforme-like e sembrava omogeneamente disperso attraverso la parete, mentre HUVEC apparso ben distribuito nel lato luminale (Figura 11). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Componenti del bioreattore statico Il bioreattore statica consisteva in un tubo da 50 ml modificata centrifuga (A) e un tappo mandrino attrezzato (B). Il tubo servito come mezzo serbatoio, ed era dotato di una porta per un filtro di 0,22 micron, per lo scambio di gas, e un setto, per il campionamento medio e cambiando. Un mandrino presente nel tappo ventilato permesso la realizzazione di costrutti in forma tubolare. La garza-impugnature (C) sono stati progettati e costruiti per supportare la gelificazione dei costrutti sul mandrino. Inoltre, questiimpugnature permesso ai costrutti da trattare dopo la maturazione statica e da fissare al apparato meccanico. Il diametro esterno del mandrino di 4,7 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2: Assemblaggio del bioreattore statica fasi del bioreattore Assemblaggio prima della sterilizzazione.. La garza-impugnature sono stati montati sul mandrino (A) ad una distanza fissa. Uno stampo è stato inserito (B) e saldamente fissato al tappo in silicone (C). Il diametro esterno del mandrino di 4,7 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3:. Fabrication dei costrutti in condizioni sterili La miscela cellule e collagene è stato versato nel complesso di alloggiamento stampo<html> (A), e lasciare il gel per 1 ora a temperatura ambiente (B). Successivamente, lo stampo è stato rimosso (C), il bioreattore statico è stato assemblato (D) e trasferito in un serbatoio per la maturazione statica del costrutto in incubatrice (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità). Il diametro esterno del mandrino di 4,7 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4:. Misurazione dello spessore / diametro esterno dei costrutti Un interferometro a scansione laser è stato utilizzato per eseguire la misura dei diametri esterni dei costrutti. Il costrutto è stato inserito nel percorso del raggio laser e genera un&#39;ombra. La larghezza dell&#39;ombra, corrispondente al diametro esterno del costrutto, è stata poi misurata e visualizzata sullo schermo. e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5:. Aspetto morfologico del costrutto raccolta (A) Subito dopo gelificazione e (B) dopo che le cellule-driven rimodellamento durante la maturazione statica per 2 settimane. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6: Experimental set-up per caratterizzazioni meccaniche Consisteva tester micromeccanica dotato di una cella di 5 o 10 N carico ed un bagno contenente PBS a 37 ° C per mantenere i campioni in condizioni pseudo-fisiologico.. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig7highres.jpg" width="700" /> Figura 7: Preparazione del campione f<html> o caratterizzazioni meccaniche. raccolta del campione (A) e preparazione (B) per prove di fatica eseguite in senso longitudinale e le direzioni circonferenziali (C). Il diametro esterno del mandrino di 4,7 mm. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig8highres.jpg" width="600" /> Figura 8: Rotazione parete bioreattore (A) I costrutti tubolari sono montati al centro del serbatoio con l&#39;aiuto di supporto in silicone a forma di c.. Entrambe le estremità del costrutto sono stati chiusi per evitare qualsiasi dispersione di soluzione HUVEC. (B) I costrutti sono stati coltivati ​​in incubatrice (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità) in rotazione a 4,02 x 10 -5 g forza per 2 giorni. 2 / 52812fig9highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 9:.. Caratterizzazioni meccaniche Risultati delle prove di fatica effettuati su costrutti a longitudinale (A) e (B) circonferenziali direzioni dopo rimodellamento delle cellule-driven <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/52812fig9highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig10highres.jpg" width="600" /> Figura 10:. Attività metabolica SMCs nei gel di collagene misurazioni del tasso di consumo di glucosio e tasso di produzione di lattato sono stati eseguiti con l&#39;analizzatore di gas del sangue ogni 2 giorni, dopo il mezzo di coltura cambio. Mezzo di coltura fresco è stato usato come un livello base per le misurazioni del glucosio e concentrazioni di lattato. Figura 11: Lumen endothelialization immagini istologiche dei radiali sezioni di costrutti tubolari.. Di Masson Tricoma colorazione dei costrutti tubolari coltivate staticamente per 1 settimana (A) e 2 settimane (B). H &amp; E colorazione di un costrutto tubolare (C). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tempo </td><td> Spessore (mm) </td><td> Compattazione (%) </td></tr><tr><td> 0 h </td><td> 4.83 ± 0.02 </td><td> 0 ± 0 </td></tr><tr><td> 2 ore </td><td> 4.26 ± 0.02 </td><td> 12 ± 0 </td></tr><tr><td> 4 ore </td><td> 4.21 ± 0.03 </td><td> 13 ± 1 </td></tr><tr><td> 6 ore </td><td> 4.06 ± 0.10 </td><td> 16 ± 2 </td></tr><tr><td> 12 hr </td><td> 3.16 ± 0.07 </td><td> 35 ± 1 </td></tr><tr><td> 1 giorno </td><td> 2.08 ± 0.11 </td><td> 57 ± 2 </td></tr><tr><td> 1 settimana </td><td> 0.68 ± 0.07 </td><td> 86 ± 1 </td></tr><tr><td> 2 settimane </td><td> 0.36 ± 0.00 </td><td> 93 ± 0 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Rapid compattazione del diametro costrutto durante la maturazione statica spessore della parete dei costrutti e il tasso di compattazione in funzione del tempo di coltura statica.. Compattazione è stata misurata determinando il diametro esterno dei costrutti tubolari con un interferometro laser a scansione (Serie 183B, LaserMike 136). Dopo 24 ore, i costrutti compattati al 57% ± 2% delle loro dimensioni stampati. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (n = 3). La presenza e l&#39;attività delle cellule viventi muscolari lisce era l&#39;unico responsabile di tale rilievo. Supplemental Video 1:. La raccolta dei gel non ristrutturato tubolare collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> Supplemento Video 2:. Le cellule-driven compattazione di gel tubolari collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video2.m4v" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> Supplemento Video 3:. La manipolazione dei gel non ristrutturato tubolare collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video3.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> Supplemento Video 4:. Manipolazione delle cellule rinnovate gel tubolare di collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video4.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere th</a>è il video. Supplemento Video 5:. Prova di fatica longitudinale (al 30%) su cellule ristrutturato gel tubolare di collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video5.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a> Supplemento Video. 6: prova di fatica circonferenziale (al 30%) su cellule ristrutturato gel tubolare di collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video6.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a>

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Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

engineering-3d-cellularized-collagen-gels-for-vascular-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.6K Views.  Laval University. In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Video: Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Ricerca

Bioingegneria

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Ingegneria dei tessuti di un Umano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema Tumore test

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

A base di seta-collagene Engineered Modello 3D del tessuto neurale polarizzata

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Multimateriali di cartilagine e pelle tessuto analoghi utilizzando un romanzo passivo unità tecnica di miscelazione per Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

Bioprinting 3D di astrociti corticali murini per l'ingegneria del tessuto neurale

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali gengivali umane primarie utilizzando Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...