Questo lavoro è stato sostenuto dalla US Army Medical Research e Materiel Command concedere # 05178001 e NS041069-06 presso l&#39;Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo. Ringraziamo Joel Vonnahme per gli utili commenti sul protocollo.

1. AGS Neural Stem Cell e Media Preparazione <ol><li> Adulti dell&#39;ippocampo scoiattolo di terra Artico (AGS), le cellule staminali neurali isolate in un modo descritto in precedenza 9 possono ora essere ottenuti commercialmente come fiale crioconservati. Le cellule sono pillole in confezioni isolati contenenti ghiaccio secco per assicurare che le cellule rimangono in uno stato crioconservati. Per mantenere l&#39;integrità, decomprimere le cellule immediatamente dopo la ricezione e conservare a inferiore a -150 ° C, o in fase vapore di un Dewar di azoto liquido. </li><li> Preparare agsNSC medio basale + 5% FBS FBS aggiungendo 5 ml (LS-1012) a 95 ml di mezzo agsNSC basale </li><li> Preparare Media agsNSC di espansione con l&#39;aggiunta di 500 microlitri B-27 Supplemento (Invitrogen) a 50 ml di mezzo agsNSC basale. Dividere il resto della B27 in 1 ml di aliquote e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Caldo 25 mL di agsNSC medio basale + 5% FBS e 20 ml di terreno di espansione agsNSC in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Fiaschi cappotto usato per l&#39;espansione con poli-L-ornitina <ol><li> Scongelare il poli-L-ornitina (10 mg / ml) soluzione di lavoro. Conservare la soluzione tra 2-8 ° C fino a un mese, una volta scongelati. </li><li> Aggiungere 8 ml di soluzione di poli-L-Ornitina lavorando ad uno sfogo T-75 pallone e distribuire uniformemente la soluzione su tutta la superficie intera cultura del pallone. (Definire la quantità di soluzione di lavoro per i pescherecci altra cultura che può essere utilizzato Usa 0.5 -.. 1,0 mL Poli-L-ornitina soluzione di lavoro per 10 cm 2 di superficie cultura) </li><li> Incubare fiaschi a 37 ° C per un minimo di 24 ore. (L&#39;uso di un incubatore senza aggiunta di CO 2 è preferibile per l&#39;incubazione di Poly-L-ornitina recipienti di coltura rivestito.) Fiaschi rivestiti possono essere conservati per un massimo di due settimane in incubatrice. </li><li> Prima dell&#39;uso, aspirare Poli-L-ornitina soluzione di lavoro dal pallone e lavare due volte con acqua sterile colture di tessuti di qualità. Aspirare il liquido fino a quando il pallone è quasi asciutto prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Rimuovere una fiala dal Dewar e controllare che il tappo del flaconcino sia ben sigillato. Tenere la parte superiore del flaconcino lasciando la metà inferiore del flacone in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per circa 60-90 secondi o fino a fiala è quasi completamente scongelati; una piccola quantità di ghiaccio dovrebbe essere ancora visibile. Per evitare potenziali contaminazioni, conservare il tappo del flacone fuori dall&#39;acqua. Non più di disgelo, in quanto ciò potrebbe danneggiare le cellule. </li><li> Spruzzare l&#39;esterno del flaconcino con 70% di etanolo o isopropanolo, poi posto la fiala in un armadio di sicurezza biologica. Togliere il tappo con attenzione per evitare la contaminazione o splatter. </li><li> Risospendere delicatamente le cellule nel flaconcino con l&#39;aggiunta di 1 ml di agsNSC mezzi basale + 5% FBS usando una pipetta sterile. Trasferire la risospensione delle cellule a 25 mL di caldo Media agsNSC basale + 5% FBS in un tubo da 50 ml per centrifuga. </li><li> Sciacquare la crio-fiala una volta con sospensione cellulare diluito. Centrifugare le cellule a 150 xg per 6 minuti. Per ottenere risultati ottimali, calcolare la velocità per ogni tipo di centrifuga individuo. </li><li> Mentre le cellule girano verso il basso, aggiungere 10 ml di terreno di espansione agsNSC al secco poli-L-ornitina rivestito T-75 beuta e aggiungere 40 ml di rh FGF-base (40ng/mL). Dopo la centrifugazione, aspirare il liquido surnatante avendo cura di non aspirare il pellet. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno di espansione agsNSC. Trasferire la ri-sospensione cellule in terreno di espansione agsNSC nei media nel T-75 pallone. </li><li> Agitare delicatamente il recipiente di coltura da lato a lato per distribuire uniformemente le cellule all&#39;interno del vaso. </li><li> Cultura nave posto seminato a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Le cellule devono allegare al pallone e cominciano a formarsi i processi entro due ore dalla semina. Se le cellule rimangono galleggianti e appallottolato all&#39;interno del mezzo, quindi centrifugare cellule in FBS 5% ed eseguire passi 1,8-1,10 con terreno fresco e pallone. </li></ol> 2. Ampliamento della AgsNSC <ol><li> Due giorni (~ 48 ore) dopo lo scongelamento e la semina delle cellule, una sostituzione medio completo dovrebbe essere eseguito utilizzando 20 ml di terreno di espansione agsNSC più un picco di 40 ml di rh FGF-base. </li><li> Fiaschi Spike con 40 ml di rh FGF-base sul inoculazione giorno successivo. Le celle saranno pronti per trypsinize quando hanno raggiunto il 75-80% confluenza con il terzo o quarto giorno dopo l&#39;inoculazione. Coltura le cellule staminali indifferenziate per più di 4 giorni dopo l&#39;inoculazione non è raccomandato perché più incubazione consentono alle cellule di cominciare a differenziare di neuroni e neuroni possono essere ferito da tripsinizzazione durante la fase 3. Il rh FGF-base può essere conservato a 4 ° C per un massimo di una settimana e ancora mantenere l&#39;attività. Il rh FGF-base può anche passare attraverso uno congelamento aggiuntivo / disgelo a -20 ° C se occorre più tempo. </li></ol> 3. Tripsinizzazione delle cellule <ol><li> agsNSC dovrebbero essere diversi passaggi 3 a 4 giorni dopo l&#39;inoculazione. Preparare una poli-L-ornitina fiasco rivestito tra 24 ore e una settimana prima passaging se il agsNSC sarà ampliato di nuovo. </li><li> Aspirare ilmedio dalla nave cultura. Aggiungere 2,5 ml di 0,05% Trypsin/0.02% EDTA (CM-0017) per la nave per ogni cm 75 2 di superficie. Agitare delicatamente per garantire tutte le cellule sono rivestite con la tripsina / EDTA. Normalmente le cellule cominciano a staccarsi dalla superficie entro 60 secondi, a seconda della confluenza delle cellule. Non più di trypsinize, in quanto questo potrebbe danneggiare le cellule. Picchiettando delicatamente il recipiente di coltura da più lati incoraggerà distacco. </li><li> Una volta che le cellule si staccano, aggiungere 10 ml di agsNSC medio basale + 5% FBS al pallone. Agitare delicatamente per assicurare tutta la soluzione tripsina viene neutralizzata. Utilizzando tecniche di laboratorio asettico, pipettare le cellule in una provetta sterile contenente 10 ml di agsNSC basale media +5% FBS. Ripetere lavando il pallone di nuovo con un ulteriore 10 ml di agsNSC medio basale + 5% FBS e si combinano con il primo lavaggio. </li><li> Cellule Centrifugare a 150 xg per 6 minuti come descritto sopra. Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero formare un ambiente pulito pellet sciolto. Aspirare tripsina e medie neutralizzato dalla provetta e risospendere il pellet cellulare in 10 ml (per T-75 fiasco) di pre-riscaldato a medio basale agsNSC + 5% FBS pipettando gentilmente su e giù 2X con una pipetta 10 ml. Eseguire un numero di celle come descritto di seguito. </li></ol> 4. Di calcolo standard per la placcatura di celle <ol><li> Utilizzando una tecnica asettica, agitare la sospensione cellulare e trasferire 15 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 15 ml di 0,4% Tricloroetano. Mescolare delicatamente e carico 10 ml di sospensione cellulare a ciascuna delle camere di un emocitometro pulito come una linea di colore conteggio Camera (catalogo # 1490: Hausser scientifico, <a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a> ). </li><li> Contare un minimo di 4 quadranti sul emocitometro. Le cellule blu che sono positivi per Tricloroetano sono morti e non devono essere conteggiati. Per la conta delle cellule preciso, il numero ottimale di cellule per quadrante dovrebbe essere 25-75 cellule. </li><li> Dopo il conteggio delle cellule, calcolare la media dei 4 quadranti. Moltiplicare la media conta delle cellule da 10.000 e per il fattore di diluizione (2 se si utilizza il volume consigliato) per determinare il numero di cellule per ml. Si noti che se la vitalità percentuale totale è inferiore al 92% ci può essere un certo numero di cause. Una delle ragioni di vitalità basso può essere più tripsinizzazione, prima di tripsina neutralizzazione con FBS. Un altro motivo potrebbe essere che la concentrazione di siero (FBS) per tripsina è troppo bassa e le cellule continuano a essere trypsinized. In terzo luogo, le cellule potrebbero essere stati troppo confluenti, provocando le cellule staminali a differenziarsi a causa di contatto cellula-cellula, portando a lesioni durante tripsinizzazione. Se questo metodo viene seguito da vicino un rendimento di 3 o più raddoppi ci si può aspettare, dando una popolazione di&gt; 4.000.000 cellule da un numero iniziale di circa 500.000. </li></ol> 5. Inoculazione di un altro pallone di espansione <ol><li> Per determinare il numero totale di cellule necessario per inoculare una nave, moltiplicare la densità di semina desiderata (6.600 cellule per cm 2 o 500.000 cellule per T-75 fiasco) per la superficie (in cm 2) della nave per essere inoculati. Se inoculando più di una nave moltiplicare il numero di cellule per nave per il numero totale di navi. Per determinare il volume (ml) di sospensione cellulare necessario per inoculare ciascuna nave, dividere il numero di cellule necessario per inoculare una nave per il numero di cellule vitali / mL nella sospensione cellulare. Se inoculando più di una nave calcolare il volume totale di sospensione cellulare necessari moltiplicando il volume necessario per una nave per il numero totale di navi da inoculare. </li><li> Centrifugare il volume desiderato di cellule in agsNSC medio basale + 5% FBS, lasciando perdere pellet. Normalmente 500.000 cellule sono portati ad un volume totale di 25 mL in agsNSC medio basale +5% FBS come descritto in precedenza. Aspirare il liquido e risospendere il pellet sciolto in 10 ml di terreno di espansione agsNSC è richiesto Questo ulteriore fase di centrifugazione per rimuovere FBS prima dell&#39;inoculazione. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato Media Expansion agsNSC al T-75 pallone. Aggiungere i 10 ml di sospensione cellulare risospeso per il T-75 Pallone poi aggiungere 40 ml di rh FGF-base al pallone. Si consideri che il tripsinizzazione e inoculazione non dovrebbe richiedere più di 1,5 ore per decidere il numero massimo di flaconi di lavorare con in qualsiasi momento. Si dovrebbe anche avere mezzi sufficienti per completare le modifiche dei media se si utilizza numerosi palloni. </li><li> Scuotere delicatamente il pallone da un lato all&#39;altro per distribuire uniformemente le cellule e il luogo in recipienti di coltura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, come descritto in precedenza. </li></ol> 6. Diluizione delle cellule per l&#39;inoculazione dei pozzetti per la differenziazione <ol><li> Qualsiasi multi-ben formato può essere utilizzato, ma inoculazione in BD Biocoat Poli-L-lisina rivestito Piastre a 96 pozzetti è described qui. Determinare il volume di sospensione cellulare necessari per l&#39;esperimento moltiplicando il numero di pozzi di essere inoculato con 0,2 ml per bene per un multi-ben 96 piastra e aggiungere circa il 10% per coprire eventuali perdite di volume durante l&#39;inoculazione. Calcolare la diluizione di una densità cellulare di 75.000 cellule / ml. Determinare la quantità di FBS da aggiungere alla media differenziazione per ottenere una concentrazione finale del 2% FBS (Tabella 1). Mescolare la FBS e medie differenziazione. Mescolare accuratamente le celle con il volume calcolato di media Differenziazione con FBS. (Nota: Durante la centrifugazione le cellule sono in agsNSC medio basale + 5% FBS FBS Mentre protegge le cellule durante la centrifugazione e facilita l&#39;adesione delle cellule FBS inibisce differention Diluizione FBS al 2% consente l&#39;adesione delle cellule alla superficie multi-bene... Il FBS 2% è poi ulteriormente diluita per promuovere la differenziazione. Insulin-transferrina-selenio (ITS-e) è incluso anche nel medio differenziazione di promuovere la differenziazione. </li><li> In un armadio biosicurezza, dispensare 200 uL di sospensione cellulare diluito in un serbatoio Combitip sterile a ciascun pozzetto di una poli-L-lisina placca rivestita da 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale e suggerimenti orifizio di grandi dimensioni. Incubare le piastre per 1,5-2 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Dopo che le cellule hanno attaccato, dopo circa 90 a 120 minuti, rimuovere con attenzione il 50% (100 microlitri per 96 pozzetti) del mezzo da ogni orifizio suggerimenti e di grandi dimensioni utilizzando pipetta. Ricollocare accuratamente il volume rimosso con acqua calda Media Differenziazione agsNSC, sempre con grande puntali orifizio. (L&#39;uso di punte orifizio standard possono ferire le cellule). </li><li> Due giorni dopo l&#39;inoculazione (~ 48 ore), effettuare un cambio medio del 50% con medie agsNSC Differenziazione e grandi puntali orifizio. </li></ol> 7. Manutenzione di neuroni <ol><li> Preparare media neuronale manutenzione utilizzando NeuraLife, glutammina e B27 per le istruzioni. Media manutenzione neuronale deve essere preparata ogni settimana. </li><li> Due giorni dopo l&#39;ultima modifica agsNSC Media differenziazione, di solito 4 ° giorno dopo l&#39;inoculazione, effettuare una sostituzione medio del 50% con medie di manutenzione neuronale. </li><li> Continuare a svolgere sostituzioni medio del 50% con medie neuronale di manutenzione ogni 2 o 3 giorni. Processi neuronali dovrebbe apparire entro un paio di giorni di cambiare a medio manutenzione neuronale. Le cellule devono essere utilizzati entro 3 settimane di essere trasferito al terreno di mantenimento neuronale. I neuroni possono essere identificati con un numero di marcatori neuronali disponibili in commercio. Astrociti anche sempre essere osservate. </li><li> Popolazioni di cultura tipicamente esprimono un rapporto superiore al 40% dei neuroni al numero totale delle cellule. L&#39;uso di mezzi di manutenzione dei neuroni diversi NeuraLife possa fornire cellule inferiori che non guardano morfologicamente mature e non possono sopravvivere a lungo in coltura. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Il suolo artico scoiattolo cellule staminali adulte neurali continueranno a raddoppiare ogni 24 ore per 3 a 5 giorni per almeno due passaggi quando seminate a 500,000-600,000 fiasco cells/75mm. Queste cellule si differenziano facilmente con la rimozione di basicFGF e B27 e la presenza di FBS 1-2% e 1% insulina / Transferrina / selenio, e diventerà TUJ1 (Covance) neuroni positiva entro 14-21 giorni (vedi Figura 2). Il rapporto tra i neuroni alle cellule totali in un range tra 40-60%, dipende dall&#39;età della cultura (Figura 3). I neuroni possono essere utilizzati per la sperimentazione di 12 giorni post-semina con almeno 21 giorni dopo la semina. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Microfotografia di AGS adulto cellule staminali neurali dell&#39;ippocampo. Microfotografia fase di adulti AGS cellule staminali neurali dell&#39;ippocampo dopo 3 giorni di crescita in agsNSC dei media basale in fiaschi rivestiti Poli-L-ornitina. Raddoppio avviene circa ogni 24 ore. Foto con ingrandimento 100X. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Micrografia fluorescente differenziate adulte AGS cellule staminali neurali dell&#39;ippocampo AGS cellule staminali neurali sono stati sottoposti a mezzi di differenziazione per 4 giorni, poi mantenuto nella Neuralife per 17 giorni in più prima della posa. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide 4% e neuroni identificati mediante TUJ1 anticorpo primario (Covance) e Alexa Fluor 568 anticorpo secondario (verde) da Invitrogen. Colorante Hoechst 33343 è stato aggiunto a macchia di tutti i nuclei (blu). Numero di cellulare, numero neurone e neurone rapporto sono stati determinati utilizzando il software neuriti escrescenza e lo strumento Arrayscan da Cellomics. Questa foto rappresenta circa il 57% dei neuroni. Ingrandimento 10X <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Numero di neuroni e Ratio Neuron di AGS differenziate le cellule staminali neurali a trecultura età AGS cellule staminali neurali sono stati sottoposti a mezzi di differenziazione per 4 giorni, poi mantenuto nella Neuralife per i giorni 12, 15 e 17 prima della posa. Le cellule sono state fissate e neuroni identificati con TUJ1 anticorpo primario (Covance). Hoechst colorante è stato aggiunto a macchia tutti i nuclei per l&#39;identificazione delle cellule totali. Numero di cellulare, numero neurone e neurone rapporto percentuale sono stati determinati utilizzando il software neuriti escrescenza e lo strumento Arrayscan da Cellomics. Valori rappresentano media di 15 pozzi per condizione + SD. Tabella 1. Esempi di calcolo utilizzato in passaging e semina <ol><li> Utilizzando 700.000 cellule / ml sospensione cellulare </li><li> Utilizzando una densità cellulare di 75.000 cellule / ml o 15.000 cellule per pozzetto di 0,2 ml in ciascun pozzetto. </li><li> Inoculando 96 pozzetti a 0,2 ml per pozzetto = 19,2 ml o desiderato volume finale 21 ml. </li><li> (Volume finale x concentrazione finale) ÷ concentrazione iniziale = volume iniziale (21 ml x 75.000 cellule / ml) ÷ 700000 = 2,25 ml </li><li> Volume di FBS in sospensione cellulare. 2,25 ml = 2,25 ml x 0,05 = 0,1125 mL </li><li> Volume di FBS necessaria in 21 ml = 21 ml x 0,02 = 0,42 ml </li><li> Volume di FBS da aggiungere a Media Differenziazione = 0,42 ml - 0,1125 ml = 0,3075 mL </li><li> Volume del mezzo di differenziazione = 21 ml - 2,25 ml di sospensione cellulare - 0,3075 ml 5% FBS = 18,44 ml. </li><li> Combina 18,44 Media Differenziazione ml con FBS 0,308 ml e aggiungere 2,25 ml di sospensione cellulare. </li></ol>

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	<li>Barnes, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+avoidance+in+a+mammal:+body+temperatures+below+0+degree+C+in+an+Arctic+hibernator.">Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator.</a> Science. 244, 1593-1595 (1989).</li><li>Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arctic+ground+squirrel+brain+is+resistant+to+injury+from+cardiac+arrest+during+euthermia.">The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia.</a> Stroke. 37, 1261-1265 (2006).</li><li>Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+epsilon+activation+delays+neuronal+depolarization+during+cardiac+arrest+in+the+euthermic+arctic+ground+squirrel.">Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel.</a> J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).</li><li>Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+tolerance+to+oxygen+and+nutrient+deprivation+and+N-methyl-D-aspartate+in+cultured+hippocampal+slices+from+hibernating+Arctic+ground+squirrel.">Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).</li><li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arctic+ground+squirrel+(Spermophilus+parryii)+hippocampal+neurons+tolerate+prolonged+oxygen-glucose+deprivation+and+maintain+baseline+ERK1/2+and+JNK+activation+despite+drastic+ATP+loss.">Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).</li><li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain.">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).</li><li>Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferating+progenitor+cells:+a+required+cellular+element+for+induction+of+ischemic+tolerance+in+the+brain.">Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).</li><li>Sung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+stimulates+proliferation+through+PKC-dependent+activation+of+ERK+and+Akt+in+mouse+neural+progenitor+cells.">Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells.</a> Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons.">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).</li><li>Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+rat+hippocampus+contains+primordial+neural+stem+cells.">The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).</li></ol>

JA Kelleher-Andersson è il fondatore di Neuronascent ed è l&#39;inventore delle applicazioni scoiattolo di terra di brevetto Artico. Neuronascent riceve royalties sulla vendita di AGS media e cellule staminali. RC McGee è un dipendente Lifeline, Inc. che distribuisce le cellule staminali neurali media e AGS.

AGS cellule staminali adulte neurali sono robusti e può essere ampliato per numerosi passaggi che li rende una fonte eccellente di cellule staminali neurali per lo studio delle proprietà delle cellule staminali neurali di base. Il tasso di espansione è di circa un raddoppio ogni 24 ore, ma queste cellule devono essere diversi passaggi prima di confluenza raggiungere perché il contatto tra le cellule favorirà la differenziazione di astrociti. Contatto mediato differenziazione quindi causa il rapporto tra i neuroni a...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>agsNSC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>FC-0004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>agsNSC Expansion kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0008</td>
<td>Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>agsNSC differentiation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0009</td>
<td>Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>NeuraLife maintenance media kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0012</td>
<td>Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser Scientific</td>
<td>1490</td>
<td><a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDBioscience</td>
<td>356516</td>
<td><a href="http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Large orifice pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>02-707-141</td>
<td>Avoids neuronal cell damage when pippetting. <a href="http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

growth and differentiation of adult hippocampal arctic ground squirrel neural stem cells

Scoiattoli artici (Urocitellus parryii, AGS) sono unici nella loro capacità di letargo con una temperatura interna del corpo vicino o sotto lo zero 1. Questi animali anche resistere al danno ischemico cerebrale in vivo 2,3 e deprivazione di ossigeno e glucosio in vitro 4,5. Queste qualità uniche fornito l&#39;impulso di isolare i neuroni AGS di esaminare le caratteristiche intrinseche dei neuroni che potrebbe spiegare la capacità dei neuroni AGS a resistere lesioni e la morte cellulare causata da ischemia e temperature estremamente fredde. L&#39;identificazione delle proteine ​​o obiettivi gene che consentono le proprietà distintive di queste cellule potrebbero essere di aiuto nella scoperta di terapie efficaci per una serie di indicazioni ischemica e per lo studio della resistenza al freddo. Adulto ippocampo AGS contiene cellule staminali neurali che continuano a proliferare, consentendo una facile espansione di queste cellule staminali in coltura. Descriviamo qui i metodi con cui i ricercatori possono utilizzare queste cellule staminali e neuroni differenziati per qualsiasi numero di scopi. Da seguire con attenzione questi passaggi il neurali cellule staminali AGS può essere espansa attraverso due o più passaggi e poi differenziato a una cultura ad alto contenuto di TUJ1-positivi neuroni (~ 50%) senza utilizzare sostanze chimiche tossiche per minimizzare il numero di cellule in divisione. Ischemia induce neurogenesi 6 e neurogenesi che procede attraverso MEK / ERK e percorsi di sopravvivenza PI3K/AKT segnalazione contribuisce alla resistenza ischemia in vivo in vitro 7 e 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., In preparazione). Un&#39;ulteriore caratterizzazione di queste cellule neurali unica possibile anticipo su molti fronti, utilizzando alcuni o tutti questi metodi.

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Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Cellule staminali neurali sono stati preparati da ippocampo di adulti non-letargo yearling scoiattoli artici (AGS). Queste cellule staminali neurali può essere espansa attraverso numerosi passaggi, differenziate e mantenuto come un neurone quasi 50:50 alla cultura gliali.

Crescita e la differenziazione degli adulti ippocampale suolo artico Cellule Staminali neurali Squirrel

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

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9.5K Views.  University of Alaska at Fairbanks. Cellule staminali neurali sono stati preparati da ippocampo di adulti non-letargo yearling scoiattoli artici (AGS). Queste cellule staminali neurali può essere espansa attraverso numerosi passaggi, differenziate e mantenuto come un neurone quasi 50:50 alla cultura gliali.

Video: Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

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Neuroscienze

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

Promozione della sopravvivenza e la differenziazione delle cellule staminali neurali con fibrina e fattore di crescita Cocktails dopo gravi lesioni del midollo spinale

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Conteggio di cellule staminali neurali L&#39;utilizzo clonali Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate new neurons, which integrate into an existing neural circuit and contribute to specific hippocampal functions. Importantly, adult neurogenesis is highly susceptible to environmental stimuli, which allows for activity-dependent regulation of various cognitive functions. A vast range of neural circuits from various brain regions orchestrates these complex cognitive functions. It is therefore important to understand how specific neural circuits regulate adult neurogenesis. Here, we describe a protocol to manipulate neural circuit activity using designer receptor exclusively activated by designer drugs (DREADDs) technology that regulates NSCs and newborn progeny in rodents. This comprehensive protocol includes stereotaxic injection of viral particles, chemogenetic stimulation of specific neural circuits, thymidine analog administration, tissue processing, immunofluorescence labeling, confocal imaging, and imaging analysis of various stages of neural precursor cells. This protocol provides detailed instructions on antigen retrieval techniques used to visualize NSCs and their progeny and describes a simple, yet effective way to modulate brain circuits using clozapine N-oxide (CNO) or CNO-containing drinking water and DREADDs-expressing viruses. The strength of this protocol lies in its adaptability to study a diverse range of neural circuits that influence adult neurogenesis derived from NSCs.

The goal of this protocol is to describe an approach for analyzing behavior of adult neural stem/progenitor cells in response to chemogenetic manipulation of a specific local neural circuit.

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance between in vitro simplification and recreating the complex in vivo environment, along with the main aim, shared by all screening strategies, of obtaining robust and reliable data, highly predictive for in vivo translation.
In the field of demyelinating diseases, the majority of drug screening strategies are based on immortalized cell lines or pure cultures of isolated primary oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from newborn animals, leading to strong biases due to the lack of age-related differences and of any real pathological condition or complexity.
Here we show the setup of an in vitro system aimed at modeling the physiological differentiation/maturation of neural stem cell (NSC)-derived OPCs, easily manipulated to mimic pathological conditions typical of demyelinating diseases. Moreover, the method includes isolation from fetal and adult brains, giving a system which dynamically differentiates from OPCs to mature oligodendrocytes (OLs) in a spontaneous co-culture which also includes astrocytes. This model physiologically resembles the thyroid hormone-mediated myelination and myelin repair process, allowing the addition of pathological interferents which model disease mechanisms. We show how to mimic the two main components of demyelinating diseases (i.e., hypoxia/ischemia and inflammation), recreating their effect on developmental myelination and adult myelin repair and taking all the cell components of the system into account throughout, while focusing on differentiating OPCs.
This spontaneous mixed model, coupled with cell-based high-content screening technologies, allows the development of a robust and reliable drug screening system for therapeutic strategies aimed at combating the pathological processes involved in demyelination and at inducing remyelination.

We describe the production of mixed cultures of astrocytes and oligodendrocyte precursor cells derived from fetal or adult neural stem cells differentiating into mature oligodendrocytes, and in vitro modeling of noxious stimuli. The coupling with a cell-based high-content screening technique builds a reliable and robust drug screening system.

Selezione ad alto contenuto di differenziazione e analisi della maturazione di colture cellulari precursori di oligodendrociti derivati da cellule staminali neurali fetali e adulte

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...