Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro per le terapie rigenerative, la facoltà di medicina del TU di Dresda, e la DFG Collaborative Research Center SFB655 (A20 sottoprogetto). BA è stato sostenuto da una borsa di studio degli scavi-BB programma, Dresda. Ringraziamo Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Lie Chichung, e Ravi Jagasia per preziosi consigli durante la creazione di elettroporazione in utero e stereotassico iniezione virale.

Nota preliminare La chirurgia deve essere eseguita da investigatori pienamente addestrati, previa autorizzazione da parte delle autorità locali per il benessere degli animali. Tutte le precauzioni devono essere adottate per ridurre al minimo il dolore e lo stress inflitto agli animali tra cui anestesia profonda, la somministrazione di analgesia postoperatoria e, per operazioni di durata superiore a 10 minuti, l&#39;applicazione di un lubrificante occhio per prevenire la disidratazione della cornea e cecità. Topi anestetizzati deve essere mantenuto costantemente caldo a 37 ° C fino a completa guarigione e ogni strumento chirurgico e la soluzione deve essere sterile. Sebbene l&#39;uso di una cappa biologica non è strettamente necessario, l&#39;operatore deve prendere tutte le precauzioni ragionevoli per ridurre al minimo la possibilità di infettare l&#39;animale durante l&#39;operazione indossando un camice da laboratorio, maschera e guanti. Allo stesso modo, ogni passo riguardante la generazione e l&#39;utilizzo di virus deve essere autorizzato e deve avvenire in zone S2 secondo le disposizioni delle autorità locali.Infine, una decontaminazione completa di tutti gli strumenti e le superfici che potrebbero essere stati a contatto con i virus devono essere eseguite in conformità alle pratiche approvati per gli impianti di disinfezione (per l&#39;HIV pulendo con il 70% Et-OH e / o autoclave). Parte 1: Ampliamento della NSC embrionali 1. Elettroporazione in utero <ol><li> Dopo la clonazione (cioè i transgeni cdk4/cyclinD1) in PCM-EGFP (Clontech) o pDSV-mRFPnls vettori 16, purificare i plasmidi EndoFree usando kit e risospendere in PBS sterile a una concentrazione di 3-5 mg / mL. Poco prima dell&#39;intervento chirurgico, miscelare i plasmidi con 0,05% in PBS FastGreen un rapporto finale di ca. 04:04:01 e centrifugare la miscela per 2 minuti a 16.000 xg per rimuovere tutti precipitati. </li><li> Caricare la miscela DNA in un bicchiere precedentemente tirato borosilicato capillare. Tirare i parametri con un P-97 estrattore pipetta sono: tiro: 200; vel: 140, tempo: 140. Calore è dato da un test rampa e dipende dalla specsacco ific dei capillari in uso. Montare il capillare sul beccuccio del PicoPump che è vicino alla piattaforma di elettroporazione in utero (Figura 1A) e, sotto uno stereomicroscopio, piegare la punta e nick in corrispondenza del punto di flesso. </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti di chirurgia in uno sterilizzatore a secco perle di vetro e profondamente anestetizzare un topo in stato di gravidanza al giorno 12-15 di gestazione con un vaporizzatore isoflurano. Posizionare l&#39;animale in posizione supina su una piattaforma di riscaldamento a 37 ° C e mantenere sotto costante somministrazione isoflurano attraverso un cono. </li><li> Rasatura la pelle dell&#39;addome, disinfettare con tempi più Betaisodona, eventualmente pulire tra con etanolo 70%, e iniettare buprenorfina (diluito in PBS) per via sottocutanea a 0,1 mg / kg concentrazione preventiva analgesico. Usando forbici sottili, effettuare un taglio longitudinale 2 centimetri della pelle e, successivamente, della parete muscolare sottostante per accedere alla cavità peritoneale. Dispensare in ca cavità peritoneale. 2ml di soluzione IUE (D-PBS contenente 100 U / ml di pen / strep) preriscaldato a 37 ° C e mantenere la soluzione su una piastra riscaldante. </li><li> Coprire il mouse con drap sterile contenente una fessura dalla quale cervice verrà rimosso. Ritrarre l&#39;incisione con un divaricatore di tungsteno, identificare l&#39;utero ed estrarlo tenendolo con una pinza tra embrioni adiacenti (Figura 1B, a sinistra) e infine si sdraiò sul drap sterile. Durante l&#39;intera operazione, risciacquare l&#39;utero con soluzione IUE per idratare la cavità organo e corpo e prevenire la disidratazione dell&#39;animale. </li><li> Maneggiare con cura l&#39;utero tenendolo tra il pollice e l&#39;indice e ruotare un embrione fino alla sua testa è visibile e orientata verso l&#39;operatore. Identificare gli emisferi telencefalici e iniettare uno di loro dal dorso-laterale. Rilasciare 1-2 microlitri della soluzione di DNA usando il pedale di un PicoPump finché il ventricolo viene delineato da FastGreen (Figura 1B, destra). </li><li&gt; Inserire l&#39;anodo degli elettrodi sul sito di iniezione e il catodo sul lato controlaterale (Figura 1C) e fornire 6 impulsi di 30 V per 50 ms con intervallo di 950 ms tra ogni impulso utilizzando un elettroporatore generare campi elettrici di forma quadrata azionato attraverso un interruttore a pedale. Evitare di posizionare gli elettrodi vicino alla placenta in quanto ciò potrebbe causare emorragie e danni l&#39;embrione. </li><li> Quando tutti gli embrioni vengono iniettati e elettroporate, posizionare l&#39;utero indietro nella cavità addominale e chiudere le pareti muscolari con un filo di sutura sutura ogni 3-4 mm. I nodi deve essere aderente al muscolo, ma non troppo stretto per consentire un po &#39;di gonfiore dei tessuti. Infine, chiudere la pelle sovrastante con clip metalliche. Disinfettare la pelle con Betaisodona, togliere il mouse dalla maschera isoflurano e trasformare in una gabbia di alloggiamento quando è completamente sveglio. Monitorare il recupero del mouse fino comportamento locomotorio è normale. </li></ol> 2. Elaborazione del samPLE <ol><li> Uno o più giorni dopo l&#39;elettroporazione, sacrificare il mouse, raccogliere gli embrioni e di individuare quelli correttamente elettroporate utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza (Figura 1D). Staccare il cervello su ghiaccio-freddo PBS, e fissare per una notte in 4% PFA (paraformaldeide in tampone fosfato pH 7,4). Alla fine, BrdU può essere somministrato prima del sacrificio secondo paradigmi diversi per indagare cinetica del ciclo cellulare e la proliferazione cellulare 3. </li><li> I cervelli vengono poi elaborati per il sezionamento e immunostaining per i marcatori diversi glia radiale, progenitori basali e neuroni (Pax6, Nestin, tbr2, Tbr1, Tuj1 ecc) per valutare l&#39;effetto dei transgeni funzionali su mirato NSC e la loro progenie che sono identificato l&#39;espressione del co-elettroporata gene reporter. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1.In elettroporazione utero. (A) Rappresentazione schematica di una piattaforma di elettroporazione in utero. (B) disegni che illustrano il posizionamento del mouse incinta durante l&#39;intervento chirurgico (a destra) e l&#39;iniezione del DNA / FastGreen miscela (blu) nell&#39;emisfero telencephalic di un embrione di topo (a sinistra). (C) Schema che mostra il posizionamento degli elettrodi a contatto con le pareti uterine con l&#39;anodo (+) adiacente al sito di iniezione (blu). Le frecce indicano la migrazione del DNA verso l&#39;anodo. (D) Foto di un mouse embrione 24 ore dopo l&#39;elettroporazione con plasmidi GFP al giorno embrionale 13. La linea tratteggiata delimita l&#39;emisfero telencephalic. Schema in A modificato da Calegari et al., 2004 17. Parte 2: Ampliamento della Adult NSC 1. Produzione di HIV-derivati ​​particelle virali <ol><li> Giorno 1: piastra 5 x 10 6 cellule 293T su un cm 10piatto con 8 ml di D-MEM contenente il 10% del calore di siero fetale bovino inattivato e 100 U / ml di pen / strep (terreno di coltura). Utilizzare 15 piatti per una preparazione virale e cultura overnight a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Giorno 2: per ogni piatto, diluire in 1 ml di pianura D-MEM 5 mg di ciascuno dei 3 plasmidi codifica per i) VSVG (tipo virus della stomatite vescicolare G) proteina dell&#39;involucro, ii) gag / pol (antigene specifico gruppo / polimerasi) e iii) un costrutto policistronico esprimere i transgeni funzionali e reporter (cioè cdk4/cyclinD1/GFP) precedentemente clonati in un vettore di HIV-based trasferimento (p6NST90) 9. Mescolare questa soluzione con 1 ml di D-MEM contenente 45 microlitri di polietilenimmina che è stato preventivamente sciolto in PBS a 1 mg / ml di soluzione concentrata, ed incubare per 15-30 min a temperatura ambiente. Nel frattempo, rimuovere il supporto dalle cellule e aggiungere 4 ml per piastra di fresco D-MEM contenente il 15% del calore di siero fetale bovino inattivato e 100 U / ml di pen / strep. Aggiungere il 2 ml di miscela di trasfezione e pernottamento cultura. </li><li> Giorno 3: aggiungere 120 ml di 500 mM Na-butirrato a piatto per migliorare l&#39;espressione dei transgeni, mescolare delicatamente e cultura per 6-8 ore dopo che sostituiscono il mezzo trasfezione con 5 ml di terreno di coltura. </li><li> 4 ° giorno: Raccogliere i surnatanti (ca. 70 ml totale), passare attraverso un filtro 0,22 micron e il trasferimento in provette per centrifuga polyallomer 2 (35 x 89 mm). Ultracentrifuga a 110.000 xg per 90 min a 4 ° C utilizzando un rotore swing. Eliminare il supernatante, aggiungere 6 ml di PBS in ogni provetta e incubare in ghiaccio per 1 ora. Risospendere il pellet e trasferirlo in una provetta da centrifuga polyallomer (14 x 95 mm). Ultracentrifuga a 110.000 xg per 90 min a 4 ° C utilizzando un rotore swing. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 50 ml di PBS, fare 5 pl aliquote e conservare a -80 ° C. Titolo virale sarà nell&#39;intervallo di 10 8 -10 9 cfu / ml. (Nota: i virus sono molto sensibili alla temperatura e stoccaggio, AVOid ri-congelamento, tenere in ghiaccio secco durante il trasporto e scongelare poco prima dell&#39;uso.) </li></ol> 2. Iniezione stereotassica <ol><li> Anestetizzare un topo 6-10 settimane con isoflurano e posizionare l&#39;animale in posizione prona su un telaio stereotassico (Figura 2A) utilizzando le barre orecchio e il palato supporto per fissare correttamente la testa. L&#39;animale viene mantenuto caldo su un rilievo di riscaldamento a 37 ° C e sotto costante somministrazione isoflurano. </li><li> Iniettare per via sottocutanea 100 pl di soluzione di buprenorfina lavorare come preventivo analgesico, barba una striscia di pelle sulla testa del mouse e disinfettare come descritto in 1.4. Usando un bisturi, fare un ca. 1,5 cm di lunghezza incisione longitudinale sulla pelle testa esporre il cranio a livello della sutura sagittale. Ritrarre la pelle e pulire delicatamente la superficie ossea, con un batuffolo di cotone sterile. </li><li> Riempire a metà un capillare di vetro (specifiche 1.2) con olio di paraffina e montarlo sulla pompa iniettore inserimentoil capillare fino al secondo anello (Figura 2B). Spostare il supporto capillare sull&#39;asse x, yez finché la punta del capillare è posizionato sul bregma, il punto di congiunzione tra le suture sagittale e laterale (Figura 2C) (da definire con l&#39;ausilio di uno stereomicroscopio), e re-set x, y, z ed i valori a 0. </li><li> Spostare il capillare da ± 1,6 mm in asse medio-laterale (x) e -1,9 mm nel asse anteriore-posteriore (y) e contrassegnare l&#39;osso con una penna marcatore chirurgico. Praticare un foro di ca. 0,5 mm di diametro sul cranio con un trapano elettrico facendo attenzione a non danneggiare il cervello. </li><li> Mettere a goccia 5 ml di sospensione virale (1 aliquota) su un pezzo di parafilm posizionato sulle barre orecchio ed immergere la punta del capillare nella gocciolina. Succhiare ca. 3,5 ml di sospensione virale utilizza un iniettore nanolitri fissato a 55 nl / sec. Eseguire questo passaggio rapidamente la goccia evapora. </li><li> Spostare il capillare al sito of iniezione e spostarlo verso il basso fino a quando la punta tocca la superficie piale. Resettare il dorso-ventrale valore asse (z) a 0. A questo punto, penetrano il tessuto con il capillare per -1,9 mm e rilasciare 1,5 ml di sospensione virale ad una velocità di 4 nl / sec. Attendere per 2-3 minuti per minimizzare il riflusso di sospensione virale attraverso la pista capillare e quindi ritrarre il capillare. Una seconda iniezione può essere eseguita nell&#39;emisfero controlaterale. </li><li> Suturare la pelle, disinfettare, e permettere all&#39;animale di recuperare da anestesia, come descritto in precedenza per elettroporazione in utero (1.8). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Stereotassico iniezione virale. (A e B) Rappresentazione schematica dei componenti necessari per eseguire l&#39;iniezione stereotassica (A) e un supporto smontato capillare che mostra l&#39;inserimento di un capillary fino al secondo anello (B). (C) Foto di testa di topo immobilizzato dalle barre orecchio e il sostegno palato con la pelle tagliata per esporre il cranio (a sinistra). L&#39;ingrandimento della scatola tratteggiata (destra) mostra le suture laterali e sagittale, il bregma, e il sito di iniezione (cerchio). 3. Trattamento del campione <ol><li> One-to-tre settimane dopo l&#39;infezione, perfusione il mouse con ca. 100 ml del 4% PFA, sezionare il cervello e post-fix durante la notte nel 4% PFA. Alla fine, BrdU e / o tamoxifen può essere somministrata prima del sacrificio secondo paradigmi diversi per indagare cinetica del ciclo cellulare e per arrestare l&#39;espressione dei transgeni virali fiancheggiati da siti loxP, rispettivamente, 9. </li><li> Il cervello può quindi essere trattati per immunoistochimica utilizzando numerosi marcatori di cellule staminali e progenitori e neuroni (ad esempio, Sox2, GFAP, Nestin, tbr2, doublecortin, ecc.) </li></ol>

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BA e FC hanno presentato una domanda di brevetto che descrive l&#39;espansione condizionale di cellule staminali somatiche adulte da cdk4/cyclinD1 virus (EP 10.160.288,6).

Un punto critico per elettroporazione in utero è la qualità e la purezza del DNA dalla sua migrazione direzionale durante la consegna dei campi elettrici dipende dalla sua carica. Protocolli per la purificazione del DNA che non comprendono la rimozione di ulteriori molecole cariche, quali endotossine, possono portare alla mascheratura delle cariche negative DNA naturali che portano alla consegna poveri. Chiaramente, toccare le pareti uterine con gli elettrodi più vicino possibile alla zona da mirata migliorerà l&#39;efficienza elettroporazione. Altrettanto importante è la qualità degli elettrodi utilizzati poiché questo è fondamentale per la consegna di campi elettrici ottimali. Micrograffi nemmeno visibili a occhio e / o residui organici, quali tracce di siero, lipidi, e così via, inevitabilmente si accumulano nel tempo portando ad elettrodi perdono le loro proprietà. Electropes Vecchio e / o sporchi sono la causa più probabile di un improvviso calo di efficienza elettroporazione e, quindi, dovrebbe essere replaced non appena questo si nota. Mentre relativamente semplice, in elettroporazione utero in genere richiede un paio di settimane di formazione al fine di raggiungere in modo soddisfacente e risultati riproducibili. Questa tecnica è molto versatile in quanto può essere applicato virtualmente a qualsiasi organo e tessuto del embrione. Certamente, organi contenenti una cavità, come il cervello, sono particolarmente facili da colpire e consentire un&#39;elevata percentuale di cellule trasfettate causa della facilità di iniettare un volume relativamente grande di DNA. Un problema comune incontrato nella creazione stereotassico iniezione virale è avere poche cellule infette e / o per individuare le zone indesiderate. Il primo problema è principalmente correlato con l&#39;iniezione di bassa titolazione virus. Cellule 293T con il minor numero di passaggi in coltura crescono più rapidamente e portare a più alti titoli virali. Utilizzando cellule di età superiore a ca. 20 passaggi non è raccomandato e mezzi di trasfezione con meno del 80% di efficienza non assicura una buonaproduzione virale. Risospensione del pellet virale è critica, la sospensione virale deve apparire grumi omogenei e virali che possono occludere il capillare deve essere evitato. I virus sono molto sensibili alla temperatura si abbassa e la conservazione a lungo termine. Per questo motivo, aliquote devono essere permanentemente conservate a -80 ° C e non può essere ricongelato. Anche in queste condizioni, una diminuzione infettività potrebbe essere osservata dopo 6-12 mesi di stoccaggio. Nelle fasi di apprendimento, si consiglia di testare il titolo virale di ogni preparazione virale e di farlo di nuovo dopo la conservazione a lungo termine. La presenza di cellule infettate in aree indesiderate del cervello può dipendere da un posizionamento non ottimale della testa del mouse sul telaio stereotassico, che richiede una certa pratica. Inoltre, è fondamentale non danneggiare la superficie del cervello durante l&#39;apertura del foro sul cranio perché altrimenti non sarà possibile ripristinare il corretto 0 sulla superficie piale, con conseguente iniezione imprecise. Le coordinateche abbiamo fornito in questo protocollo sono definiti C57/BL6 femmine 6-10 settimane e si consiglia loro ottimizzazione per ceppo diverso / età / sesso. Acquisizione di questa tecnica può richiedere più tempo rispetto a elettroporazione utero a causa delle fasi più lunghi necessari per preparare i virus e l&#39;analisi dei campioni. Si consiglia vivamente che i virus vengono utilizzati solo dopo l&#39;intervento chirurgico del mouse e l&#39;iniezione stereotassica sono diventati affidabili e riproducibili. Il primo passo per ottenere questo è quello di iniettare cellule permeanti coloranti DNA, come Hoechst 33342, in topi eutanasia e analizzare i cervelli immediatamente. In elettroporazione utero e iniezione stereotassica virale sono due potenti sistemi di acutamente e tessuto-specifica manipolare l&#39;espressione genica nel sistema nervoso centrale durante lo sviluppo dei mammiferi e l&#39;età adulta. Nonostante la loro limitazione in termini di orientamento solo una sottopopolazione di cellule, questi sistemi offrono una velocità senza precedenti e facilità rispetto ai metodi più tradizionali, in particolare, la generazione laboriosa e che richiede tempo di topi transgenici. Eppure, nonostante questa somiglianza, esistono molte differenze tra le due tecniche che sono degni di nota. Primo, per quanto riguarda l&#39;orientamento dei diversi tipi di cellule, elettroporazione in utero comporta inizialmente la trasfezione di cellule staminali corrette (chiamato anche cellule gliali radiali) perché queste sono le uniche cellule che delimitano il ventricolo cui viene iniettato il DNA. Come risultato di divisioni cellulari, plasmidi saranno successivamente ereditato da cellule madri mirati, staminali per loro progenitore e / o cellule figlie neuronali che portano alla ridistribuzione di cellule trasfettate in tutta la corteccia come una funzione del tempo. Al contrario, l&#39;utilizzo di lentivirus HIV nel cervello adulto conduce alla infezione simultanea di qualsiasi tipo di cellula incluse cellule staminali, progenitori, neuroni nonché maturi cellule gliali. Di nota, per quanto riguarda usando lentivirus HIV rispetto a retrovirus più comunemente usato è il fattoche l&#39;integrazione lentivirale avverrebbe indipendentemente dallo stato mitotico delle cellule, consentendo così di mira anche di adulti, cellule staminali quiescenti. In secondo luogo, un altro importante differenza tra elettroporazione e infezione virale è che un transitorio, espressione episomale si ottiene la prima rispetto alla integrazione irreversibile di DNA nel genoma delle cellule infette conseguiti da quest&#39;ultimo. Come risultato di divisioni cellulari consecutive, diluizione dei plasmidi elettroporate e degradazione della proteina cyclinD1 ectopica, deriverebbero ad ogni ciclo cellulare. Così, l&#39;espansione del NSC durante lo sviluppo embrionale è stato dimostrato solo all&#39;ultimo per circa due giorni 15, mentre nel cervello adulto questo effetto è risultato dura per diversi mesi (risultati non pubblicati). In terzo luogo, poiché i) cdk4/cyclinD1 ha un effetto più forte sulle cellule con un G1 più lunga e ii) commessi progenitori neurali durante lo sviluppo hanno un più lungo ciclo cellularerispetto alle cellule staminali, mentre vale il contrario durante l&#39;età adulta, i nostri due manipolazioni sono stati trovati per innescare l&#39;espansione, in primo luogo, dei progenitori neurali durante lo sviluppo delle cellule staminali e in età adulta. In entrambi i casi un aumento neuroni è stato raggiunto con entrambi i metodi. Quarto, iniezione virale può essere facilmente eseguita, affidabile e riproducibile, in diverse regioni del cervello adulto semplicemente cambiando le coordinate stereotassico. In contrasto, il targeting preciso di certe regioni del sistema nervoso centrale, come tronco cerebrale, formazione dell&#39;ippocampo, o al midollo spinale, da elettroporazione in utero potrebbe essere più difficile da raggiungere riproducibile. Inoltre, mentre l&#39;iniezione stereotassica può essere eseguita su topi di ogni età, prestazioni ottimali di elettroporazione in utero è limitata da circa E11 a E16. Fasi prima della E11 sarebbe necessario o l&#39;uso di un microscopio backscatter ecografia 18,19 o un culto embrione interoure sistema 17,20. Recentemente, un crescente interesse per la biologia cellulare di base delle cellule staminali somatiche è stato promosso perché il loro studio e la manipolazione si pensa di essere fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie rigenerative basate sulle cellule. In particolare per la sovraespressione di cdk4/cyclinD1, nostro protocollo fornisce i mezzi per aumentare transitoriamente l&#39;espansione di NSC in vivo (Figura 3B e 4B e C e C), al fine di aumentare il numero di neuroni generati nel cervello adulto. Noi crediamo che queste manipolazioni può essere importante in una serie di contesti diversi per comprendere meglio il ruolo di NSC nello sviluppo del cervello, l&#39;evoluzione e l&#39;omeostasi e il loro contributo alla funzione cognitiva o di recupero da degenerazione neurale o lesioni.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale / attrezzature </td><td> Fornitore </td><td> Catalogare # </td><td></td></tr><tr><td> Endofree kit maxi plasmide </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming / Brown pipetta estrattore </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato capillari con filamento </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> Piano degli animali da laboratorio sistema di anestesia </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Baxter </td><td> HDG9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinator 500 perle di vetro sterilizzatore </td><td> Southpointe chirurgico </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> Iris pinza </td><td> WPI </td><td> 15917 </td><td></td></tr><tr><td> Betaisodona soluzione </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> Pico della pompa </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 onda quadra elettroporatore </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> Elettrodi pinzetta rotonde </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> Materiale di sutura </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> RiflessoClip applicatore per la chiusura della ferita </td><td> WPI </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione iniettabile Temgesic </td><td> Essex Pharma AG </td></tr><tr><td> DMEM w / Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale Bovin </td><td> Invitrogen </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / Streptomicin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue cultura piatto </td><td> Falco </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilenimmina 250 ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> n-butirrico, sale di sodio </td><td> Sigma </td><td> B 5887 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Tube, pareti sottili, polyallomer </td><td> Beckman </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> Modello 900 piccoli animali strumento stereotassico </td><td> Kopf Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OPMI pico microscopio </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 controller e Nanoliter2000 iniettore </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro di ricambio 3,5 nanolitri </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR trapano generale applicazione </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td><strong&gt; Anticorpo </td><td> Fornitore </td><td> Catalogare # </td><td> Diluizione </td></tr><tr><td> Doublecortin </td><td> Santacruz </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> BD Biosciences </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> Millipore </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> Tabella di anticorpi. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

Cellule staminali somatiche possono dividersi per generare cellule staminali aggiuntivi (espansione) o tipi di cellule più differenziate (differenziazione), che è fondamentale per la formazione dei tessuti durante lo sviluppo embrionale e l&#39;omeostasi dei tessuti durante l&#39;età adulta 1. Attualmente, grandi sforzi sono investiti verso controllando il commutatore di cellule staminali somatiche dall&#39;espansione alla differenziazione perché questo è pensato per essere fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie per 1,2 medicina rigenerativa. Tuttavia, una sfida importante nello studio e l&#39;uso di cellule staminali somatiche è che la loro espansione è dimostrato molto difficile da controllare. Qui si descrive un sistema che permette il controllo della neurali staminali / progenitrici cellule (complessivamente indicati come NSC) espansione nel topo embrionale o corteccia dell&#39;ippocampo adulto manipolando l&#39;espressione del complesso cdk4/cyclinD1, un regolatore della fase G1 del ciclo delle cellule somatiche e cellule staminali differentiation 3,4. In particolare, due differenti approcci sono descritti con cui il complesso cdk4/cyclinD1 è iperespresso in NSC in vivo. Dal primo approccio, la sovraespressione di regolatori del ciclo delle cellule viene ottenuta iniettando plasmidi codificanti per cdk4/cyclinD1 nel lume del telencefalo topo seguita da elettroporazione in utero consegnate al NSC della corticale laterale, quindi, innescando espressione episomale del transgeni 5-8. Con il secondo approccio, altamente concentrati HIV-derivati ​​virus sono stereotaxically iniettati nel giro dentato dell&#39;ippocampo topo adulto, quindi, innescando espressione costitutiva di regolatori ciclo cellulare dopo l&#39;integrazione del costrutto virale nel genoma delle cellule infette 9. Entrambi gli approcci, i cui principi di base sono stati già descritti da altri protocolli video 10-14, sono stati qui ottimizzato per i) ridurre i danni ai tessuti, ii) porzioni di destinazione a livello di cervello regio molto specificons, iii) ottenere un numero elevato di cellule manipolate all&#39;interno di ogni regione, e iv) attivare elevati livelli di espressione dei transgeni all&#39;interno di ogni cella. Sovraespressione transiente dei transgeni utilizzando i due approcci è ottenuto mediante diverse cioè da diluizione naturale dei plasmidi elettroporate causa di divisione cellulare o tamoxifene somministrazione in Cre-esprimendo NSC infettato da virus che trasportano cdk4/cyclinD1 fiancheggiati da siti loxP, rispettivamente 9,15 . Questi metodi forniscono una piattaforma molto potente per manipolare acutamente e tessuto-specifico l&#39;espressione di un gene nel cervello di topo. In particolare, manipolando l&#39;espressione del complesso cdk4/cyclinD1, il nostro sistema consente il controllo temporale di espansione NSC e la loro differenziazione interruttore, quindi, in ultima analisi, aumentando il numero di neuroni generati nel cervello dei mammiferi. Il nostro approccio può essere di fondamentale importanza per la ricerca di base e l&#39;utilizzo di cellule staminali somatiche per la terapiadel sistema nervoso centrale dei mammiferi, fornendo una migliore comprensione di i) staminali contributo alla formazione di tessuto cellulare durante lo sviluppo, ii) l&#39;omeostasi dei tessuti durante l&#39;età adulta, iii) il ruolo della neurogenesi adulta delle funzioni cognitive, e forse, iv) un migliore utilizzo staminali somatiche cellule in modelli di malattie neurodegenerative.

<ol><li> Nel complesso, elettroporazione in utero produce 60-80% di embrioni elettroporate mostrano forte espressione del gene reporter in una vasta area della corteccia laterale (Figura 3A). Proteine ​​fluorescenti possono essere facilmente individuati su embrioni interi montaggio appena 3-6 ore dopo l&#39;intervento con il segnale dura per più di una settimana. All&#39;interno della zona mirata, circa il 30-50% di cellule normalmente esprimono il transgene (s) e la percentuale di cellule co-esprimono due (o più) co-elettroporate transgeni generalmente superiore al 90% (Figura 3B, sinistra) 6,8 , 15. Mentre un livello minimo di apoptosi (ca. 2,0-2,5%) è stato osservato dopo circa 2 ore di elettroporazione, questo valore tornerà a livelli fisiologici (ca. 0.5-1.0%) dopo circa 6 ore (FC, dati non pubblicati). La proporzione di embrioni o topi incinte muoiono a causa della chirurgia è generalmente trascurabile (&lt;5%). Co-elettroporazione con cdk4/cyclinD1 in queste condizioni, seguito da 48 ore di sviluppo provoca un aumento della espansione di progenitori neurali del 30% (Figura 3B, a destra, e C) 15. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Espansione di progenitori neurali da cdk4/cyclinD1 sovraespressione. (A) foto fluorescenza di una sezione attraverso la corteccia laterale di un embrione di topo 24 ore dopo l&#39;elettroporazione con plasmidi GFP e RFP al giorno embrionale 13. (B) le immagini fluorescenti come in una 48 ore dopo il co-elettroporazione con plasmidi cdk4/GFP e cyclinD1/RFP e immunomarcatura per il marcatore progenitore basale tbr2. Reporter fluorescenti con DAPI counterstainig (a sinistra) e tbr2 (a destra) sono mostrati. Linee indica la superficie apicale della zona ventricolare (VZ; linea bianca) ed i confini della zona subventricolare (SVZ; giallo linee tratteggiate). Notare la maggiore thickness della SVZ nella porzione elettroporate della corteccia (frecce bianche) a causa di un aumento di generazione e l&#39;espansione di progenitori basali dopo sovraespressione di cdk4/cyclinD1. (C) Quantificazione degli effetti presenti in bar B. = SD, p &lt;0.05, n = 3. Grafico a barre in C è preso da Lange et al., 2009 15. <ol start="2"><li> Dopo iniezione virale stereotassico, ca. 80% dei topi operati visualizzare forte espressione dei transgeni in tutto il giro dentato tutto. Espressione costitutiva di GFP può essere facilmente rilevato su 40 sezioni micron appena 4 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. Lungo la rostrale-to-caudale all&#39;asse del giro dentato, circa il 10-30% delle cellule (equivalente ad un totale di ca. 10,000-30,000 cellule) solitamente esprimono il transgene (s) (Figura 4A) 9. La proporzione di topi muoiono a causa della chirurgia è trascurabile (&lt;5%). Tre sovraespressione settimana di cdk4/cyclinD1 in queste condizioni provoca un aumento della NSC di oltre duepieghe (Figura 4B) sono diminuite neurogenesi del 70% (Figura 4C) 9. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Effetti di infezione virale. (A) ricostruzione 3D di immagini 7 fluorescenza prese da 40 micron di spessore sezioni seriali coronali (raccolta 1 ogni 6) lungo il rostrale-to-caudale asse dell&#39;ippocampo. GFP + cellule infette (verde) e la colorazione DAPI nucleare (blu) del giro dentato sono riportati (in alto). Immagini in campo chiaro delle sezioni coronali corrispondenti a quelli indicati in A (al centro) e la rappresentazione 3D (in basso) di tutto l&#39;emisfero cerebrale con l&#39;ippocampo evidenziato in verde pseudocolore (modificato dal cervello Allen Atlas; <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . Frecce bianche puntare il sito di iniezione. Laterale (L), rostrale (R), e dorSAL (D) assi (x, y, z coordinate stereotassico) sono indicati (destra). (B e C) Percentuale di nestina + NSC (B) e DCX + neuroni neonati (C) all&#39;interno della popolazione di GFP + cellule infette 3 settimane dopo l&#39;iniezione stereotassica di GFP (bianco) o cdk4/cyclinD1/GFP (nero) virus. Bar = SD, p &lt;0.005, n = 3. Grafici in B e C tratto da Artegiani et al., 2011.

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Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controllare l&#39;espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l&#39;uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

16.6K Views.  DFG - Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies Dresden, Germany. Controllare l'espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l'uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

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Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

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Neuroscienze

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Generazione di topi transgenici per uso topico<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione e<em&gt; In vivo</em&gt; Screening bioluminescenza

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

Riprogrammazione diretta in vivo delle cellule gliali residenti negli interneuroni mediante iniezione intracerebrale di vettori virali

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

In Vivo Targeting di cellule progenitrici neurali in Ferret Neocortex di In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

Colture organotipiche della corteccia umana adulta come modello ex vivo per il trapianto e la validazione di cellule staminali umane

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...