In passato la caratterizzazione dell'immunoterapia nel modello della cavia si limitava a misurare l'immunità umorale. Il saggio ELISpot supera tale limitazione e aiuterà i ricercatori a generare dati più significativi in quel modello animale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule sono ottenute dal sangue periferico.
Non è richiesta necroscopia. Ciò consente la misurazione non solo della magnitudine, ma anche della cinetica delle risposte delle cellule T nei singoli porcellini d'India durante un'infezione naturale o in tutto un regime vaccinale. A dimostrare la procedura sarà Holly Pugh.
È una ricerca associata al Dipartimento di Ricerca e Sviluppo Preclinico di Inovio. Per iniziare aggiungere 15 microlitri di etanolo al 35% a ogni pozzo di una piastra di dosaggio ELISpot. Dopo 60 secondi aggiungere 150 microlitri di PBS ad ogni pozzo.
E invertire il piatto per fermare il pretrattamento dell'etanolo. Grande attenzione dovrebbe essere esercitata anche quando si maneggiano le piastre di dosaggio ELISpot per evitare la contaminazione o danneggiare la membrana. Per lavare la piastra aggiungere 250 microlitri di PBS ad ogni pozzo.
Dopo aver ripetuto il lavaggio altre due volte, aggiungere 100 microlitri di anticorpo gamma interferone anti-porcellino d'India VE4 ad ogni pozzo. Quindi incubare la piastra per almeno 12 ore a 4 gradi Celsius. Dopo il periodo di incubazione lavare le piastre tre volte.
Aggiungere 200 microlitri di buffer di blocco ad ogni pozzo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore. Quindi lavare i piatti altre tre volte.
Preparare tubi conici con 4,5 ml di mezzo gradiente di densità di temperatura ambiente. Quindi mescolare un volume uguale di soluzione salina equilibrata di Hanks con il sangue. Sovrapporre gradualmente il sangue diluito sul mezzo gradiente di densità, facendo attenzione a non disturbare l'interfaccia.
Successivamente, centrifugare i tubi a 800 x g per 30 minuti senza freni a temperatura ambiente. Rimuovere il tubo dalla centrifuga, facendo attenzione a non disturbare gli strati. Dopo aver identificato correttamente gli strati, aspirare lo strato completo di mantello buffy per raccogliere i PBPC.
Stratificazione lenta del sangue diluito HBSS sul mezzo gradiente di densità. Evitare qualsiasi disturbo del tubo e spegnere i freni della centrifuga. Trasferire le celle in un nuovo tubo da 15 ml.
Quindi diluire le cellule in R10 medio a un volume totale di 15 ml. Dopo aver pelletato le cellule, scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 15 ml di mezzo R10. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un nuovo tubo.
Contare le celle e determinare il numero di celle viventi con il test di esclusione blu di Trypan. Quindi diluire le cellule con mezzo R10. Rimuovere innanzitutto il tampone di blocco e lavare le piastre.
Per ogni campione PBMC indicare triplicati del controllo positivo, del controllo negativo e di ogni stimolante specifico dell'esperimento. Diluire il pool di peptidi proteici in R10 medio-tre volte la concentrazione finale desiderata. Dopo questo aggiungere 50 microlitri della miscela media peptidica R10 ai pozzi di prova stimolanti della piastra.
Quindi aggiungere 50 microlitri di formulazione peptidica MT in mezzo R10 ai pozzi di controllo negativi della piastra. Aggiungere ConA in R10 medio ai pozzi di controllo positivi della piastra, quindi aggiungere 100 microlitri della sospensione PBMC a tutti i pozzi. Posizionare la piastra ELISpot su una superficie uniforme nell'incubatore ed evitare di disturbare la piastra durante il periodo di incubazione.
Dopo aver rimosso con cura la piastra dall'incubatore, invertire la piastra per rimuovere il supernatante. Quindi lavare il piatto tre volte. Aggiungere 100 microlitri di rivelazione biotinilata diluita cattura anticorpi gamma interferone anti-porcellino d'India N-G3 ad ogni pozzo.
Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore. Invertire la piastra per rimuovere la soluzione anticorpale e ripetere il lavaggio tre volte. Dopo aver rimosso il PBS dalla piastra, aggiungere 100 microlitri di streptavidina coniugata ALP diluita in tampone di blocco ad ogni pozzo.
Quindi incubare il piatto a temperatura ambiente per un'ora. Invertire la piastra per scartare la soluzione di streptavidina ALP e lavare la piastra due volte. Invertire la piastra e tamponarla contro un tovagliolo di carta pulito per rimuovere eventuali PBS in eccesso.
Dopo questo lavare la piastra con 250 microlitri di acqua Ultrapure DI per pozzo. Invertire la piastra e rimuovere l'acqua in eccesso con un tovagliolo di carta pulito. Aggiungere quindi 100 microlitri di soluzione di substrato BCIP/NBT ad ogni pozzo.
Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti protetti dalla luce. Risciacquare il piatto quattro volte con acqua DI. Quindi invertire e toccare la piastra per rimuovere l'acqua in eccesso.
Infine, rimuovere il drenaggio in plastica dal fondo della piastra e lasciare asciugare completamente la membrana. Dopo aver avuto successo nella centrifugazione del gradiente di densità come precedentemente dimostrato, il liquido viscoso rosso nella parte inferiore del tubo dovrebbe contenere la maggior parte dei globuli rossi. Lo strato di mantello buffy si trova tra lo strato di plasma e il mezzo gradiente di densità.
Pretrattando i pozzi prima di aggiungere l'anticorpo di cattura, il saggio ha mostrato una migliore definizione insieme a una riduzione del numero di punti non specifici nei pozzi di controllo negativi. Le macchie sono indicative dell'interferone gamma che produce cellule T all'interno della popolazione PBMC. Quando si tenta questa tecnica, è importante ricordare di elaborare attentamente ma rapidamente il sangue.
Ciò migliorerà la vitalità cellulare, migliorerà la formazione di punti e ridurrà la formazione di macchie non specifiche. Non dimenticare che lavorare con sangue e substrato BCIP / NBT può essere pericoloso e precauzioni come indossare DPI appropriati devono sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura. Credo che questo protocollo consenta ai ricercatori di studiare malattie con un importante componente di cellule T come TB, Ebola e HSV.
È importante sottolineare che raffinerà lo sviluppo di protocolli vaccinale nel modello della cavia e ridurrà l'uso di modelli animali meno rilevanti.
