Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da un Grow Fondo Iowa premio Valori da BFBS.

1. Campionamento superficie con del nastro adesivo sterile <ol><li> Selezionare un nastro da utilizzare per il campionamento. Disponibili in commercio funghi-Tape o Con-Tatto-It nastri di campionamento sono sterili e appositamente confezionati per la facilità d&#39;uso. Tuttavia, abbiamo scoperto che trasparente (otticamente chiaro) nastro ufficio generico può anche essere usato. </li><li> Utilizzare un pennarello indelebile per disegnare 1 cm 2 quadrati sulla non appiccicoso lato di un pezzo di 10 centimetri di nastro adesivo (un modello di carta può essere utilizzata). Questo servirà come guida visuale per notare che parte del nastro è stato utilizzato per campionare la superficie alimentare o ambientale. </li><li> Formare una &quot;C&quot; a forma di anello di nastro, con la parte adesiva verso la superficie da campionare. Per fare questo, tenere le estremità adesive con il pollice e il medio e posizionare il dito indice contro il quadrato disegnato sul retro (non appiccicosa lato) del nastro (Figura 1). </li><li> Posizionare il nastro sulla superficie da campionare e premere delicatamente la zona segnata contro la superficie. Senza rilasciare i bordi del nastro, utilizzare il dito indice per garantire che la parte adesiva del nastro viene a contatto con la superficie del campione, evitando le bolle. </li><li> Utilizzando un movimento anche, tirare lentamente il nastro lontano dal campione, l&#39;estrazione di superficie fisicamente legato microbi. Fissare la cellula carica nastri, lato adesivo alto, su un vetrino di vetro con il nastro trasparente generico ufficio. Garantire la giusta tensione / allungamento del nastro in modo che un appartamento, non rugosa superficie è creato. Questo aiuterà a ridurre i problemi di deformazione / arricciatura del nastro durante il successivo riscaldamento durante l&#39;ibridazione. </li></ol> 2. Fase solida arricchimento e Miniculture superficie del liquido <ol><li> In fase solida arricchimento viene eseguito ponendo il nastro a faccia in giù su xilosio-lisina-Tergitol 4 (XLT-4) piastre di agar in modo che le cellule campionate sono posti in contatto diretto con la superficie agar. La parte templated contatto / campione del nastro è posto a filo con la superficie di agar e una delle estremità del nastro è liberamente aderito alla parete laterale della scatola di Petri di facilitarne la rimozione del nastro dalla superficie agar seguenti arricchimento. </li><li> Le piastre sono invertiti (per evitare la condensazione) e incubate a 35 - 37 ° C per consentire una crescita sufficiente di Salmonella spp. La lunghezza del periodo di incubazione necessario per arricchire le cellule ad un livello rilevabile dipende dai livelli iniziali contaminazione da Salmonella. Abbiamo osservato la formazione eccellente microcolony dal basso inoculo iniziale dopo 8 ore di arricchimento. </li><li> Dopo il periodo di arricchimento desiderato, aprire la piastra di agar. Il nastro manterrà la sua appiccicosità durante l&#39;incubazione. Premere delicatamente il nastro contro l&#39;agar con il dito indice per garantire il recupero massimo di microcolonie formato a nastro-agar interfaccia. Afferrare il nastro dal bordo attaccata alla parete della scatola di Petri e rimuoverlo con un lento, anche il movimento. Montare il cellulare a carica nastro, lato adesivo alto, su un vetrino da microscopio, come descritto al punto 1.5. Procedere al punto &quot;fissazione e disidratazione&quot; di seguito. </li><li> Per miniculture superficie del liquido, iniziare il fissaggio del nastro utilizzato per il campionamento su un vetrino da microscopio, come descritto al punto 1.5. Successivamente, coprire la parte basati su modelli di contatto / campione del nastro con un non-sterile camera di silicone perfusione (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), formando una camera stagna cui fondo è composto di cellule carica nastro, rivolta verso l&#39;alto. Con fermezza, ma premere delicatamente la camera in posizione per assicurare la tenuta stagna. </li><li> Utilizzando un gel di carico flessibile puntale, trasferimento ≤ 500 microlitri brodo di soia Trypticase o altro mezzo idoneo di arricchimento attraverso una delle porte piccola insenatura della camera. Seal entrambe le porte con del nastro adesivo trasparente ufficio per evitare l&#39;evaporazione diapositive e incubare a 35 -37 ° C come necessario per l&#39;arricchimento sufficiente. Anche se tutte le operazioni devono essere eseguite secondo le buone pratiche di campionamento e la manipolazione, la sterilità di porta-nastro di tenuta o camere perfusione non è necessaria durante miniculture superficie del liquido. La combinazione di FISH e citometria a flusso consentirà discriminazione chiaro di Salmonella spp. da non bersaglio batteri che possono essere presenti, con il più grande contributo di non bersaglio flora dovrebbe provenire dal campione stesso. Procedere al punto &quot;fissazione e disidratazione&quot; di seguito. </li></ol> 3. Fissazione e disidratazione <ol><li> Per il campionamento di superficie diretta o per l&#39;arricchimento in fase solida di Salmonella spp. XLT su agar-4, eseguire on-nastro fissazione delle cellule per 30 minuti a 25 ° C, coprendo l&#39;area di contatto del campione con 500 microlitri 10% formalina tamponata neutra. </li><li> Scartare fissativo in un contenitore sigillabile (sotto una cappa chimica per minimizzare l&#39;esposizione a irritanti / vapori tossici). </li><li> Disidratare in una serie di etanolo (50%, 80% e 95%, 300 ml / 3 minuti per ogni concentrazione). Passare al punto &quot;ibridazione&quot; di seguito. </li><li> Per il fissaggio del campione di 500 microlitri di liquido miniculture superficies, camere di perfusione sono sigillate, e un flessibile gel-loading puntale viene utilizzato per estrarre il enrichate. Pipettaggio rapido su e giù è usato per contribuire ad assicurare la rimozione efficace di qualsiasi nastro residuo legato cellule. </li><li> Successivamente, l&#39;intero volume di 500 microlitri miniculture è trasferito in una provetta e centrifugare a 2.000 xg (5 min). Il supernatante viene scartato, il pellet è in agitazione energicamente per 30-60 s, quindi risospeso in un volume pari al 10% formalina tamponata neutra. Le cellule sono fissate per 30 minuti a 25 ° C. </li><li> Successivamente, fissativo viene rimosso e il campione viene risospeso in un tampone di cella di stoccaggio, come segue. Il campione viene centrifugato a 2.000 xg (5 min, 25 ° C) il supernatante viene scartato, il pellet è in agitazione energicamente per 30 - 60 s, il risospesi in un volume pari al 50% di etanolo non denaturato-50%-fosfato soluzione salina tamponata. Cellule fisse possono essere conservati a tempo indeterminato (anni) a -20 ° C. Nota: Ogni volta che i liquidi sono cambiati (ad esempio, quando l&#39;introduzione di un buffer di fissativo o diverso), è importante per sospendere di nuovo a fondo (con vortex) il pellet di cellule in una porzione minima (~ 10-20 mL) del sistema &quot;in uscita&quot; liquido . Questo aiuterà a prevenire aggregazione e di garantire che le sospensioni, anche di singole cellule si ottengono. Passare al punto &quot;ibridazione&quot; di seguito. </li></ol> 4. Ibridazione <ol><li> Preparare ibridazione / tampone di lavaggio utilizzando il commerciale biologia molecolare-grade soluzioni indicato nella tabella dei Materiali. Finale concentrazioni dei componenti del buffer sono 0.7 M di NaCl, 0,1 M TRIS [pH 8,0], 10 mM EDTA, solfato di sodio 0,1% dodecil, composto al volume finale desiderato con molecolare acqua di grado e filtrata con una siringa da 0,22 micron o filtro tazza. Il buffer stesso, senza l&#39;aggiunta di sonde (vedi sotto) è usato come tampone di lavaggio. Preriscaldare il buffer di ibridazione e lavaggio a 55 ° C. </li><li> Aggiungi fluorescenza marcata Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5&#39;-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 &#39;) e Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5&#39;-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3&#39; ) sonde oligonucleotidiche (Tabella Materiali) al buffer di ibridazione preriscaldato. Una concentrazione sonda totale di 5 microlitri -1 ng viene utilizzato (ad esempio 2,5 ng microlitri -1 ogni sonda; Bisha e Brehm-Stecher, 2009a). </li><li> Per i campioni di fase direct-to-tape e solida arricchimento, sovrapporre il template area di contatto campione del nastro con 300 l di tampone di ibridazione contenente il cocktail della sonda e ibridare nastro legato cellule in un umido, camera di incubazione sigillata impostato a 55 ° C. Se un contatto diretto come lo strumento Fossato Slide (Tabella Materiali) incubatore è usato, i campioni sono ibridate per 15 min e&gt; 20 diapositive possono essere trattati simultaneamente. Se un rotante in stile fornetto come lo strumento Bambino (Tabella Materiali) è usato, gli scivoli sono posti in provette da 50 ml per centrifuga in polipropilene per l&#39;ibridazione, uno scivolo per provetta. Poiché il trasferimento di calore non è diretto, questi campioni sono ibridate per periodi più lunghi (fino a 30 min). </li><li> Dopo l&#39;ibridazione, le diapositive vengono rimossi e la sonda overlay contenente tampone di ibridazione viene scartato. Le diapositive vengono poi brevemente e delicatamente sciacquati con preriscaldato tampone di lavaggio pipettando un piccolo volume di tampone su un vetrino inclinato (3 risciacqui di 300 ogni mL), o formalmente lavato (fino a 30 min) o con una sovrapposizione di tampone di lavaggio preriscaldato o immersione in un tubo di polipropilene da 50 ml per centrifuga contenente tampone preriscaldato lavaggio. Nella nostra esperienza, anche se un lavaggio formale fornirà risultati migliori (meno foschia dalla sonda non legata), un semplice risciacquo è sufficiente per l&#39;individuazione univoca di Salmonella spp. Successivamente, le diapositive sono essiccati all&#39;aria, prima di passare alla fase &quot;Rivelazione&quot; di seguito. </li><li> Ibridazione di campioni liquidi miniculture superficie viene effettuata riducendo la velocità campioni (fresco fisso o tenuti in soluzione per la conservazione a -20 ° C) per 5 min a 2.000 xg, seguita da vortex vigorosa del pellet e risospensione in 100 microlitri di buffer di ibridazione preriscaldato contenente la sonda cocktail. I campioni sono ibridate a 55 ° C per 30 minuti su un blocco di calore o di altri stazione incubazione adatto (Tabella Materiali), seguita da aggiunta di 500 microlitri di lavaggio tampone preriscaldato. Come con il nastro legato campioni, questi campioni possono essere lavati formalmente per un massimo di 30 minuti con ulteriore incubazione a 55 ° C in questo tampone di lavaggio, con vortex intermittente. In alternativa, i campioni possono essere completamente in agitazione dopo l&#39;aggiunta di 500 microlitri di buffer di lavaggio preriscaldato, seguita dalla raccolta immediata per l&#39;analisi (in basso). </li><li> In preparazione per il rilevamento di Salmonella spp. mediante citometria a flusso, i campioni di liquido miniculture superficie sono centrifugare a 2.000 xg per 5 minuti, il supernatante viene scartato ed i campioni sono risospesi in 300 microlitri temperatura ambiente (~ 25 ° C) PBS. Se i campioni necessitano di trasporto in una struttura lontana, o se il ritardo è prevista tra ibridazione e di analisi, i campioni possono essere refrigerati o in attesa sul ghiaccio prima di analisi. In alternativa, i campioni possono essere trasferiti al buffer di cella di stoccaggio (50:50 miscela di PBS e etanolo assoluto) e ha tenuto a -20 ° C per un massimo di una settimana senza perdite apprezzabili sonda conferito fluorescenza (Bisha e Brehm-Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. Rivelazione <ol><li> Per il nastro di rilevamento di Salmonella spp. tramite microscopia a fluorescenza, direct-to-tape o solido campioni arricchimento fase sono sovrapposti con ~ 10 L Vectashield H-1200 mezzo di montaggio contenente il nucleare di contrasto 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), montati con un vetrino, poi incubate al buio per 10 minuti. </li><li> Olio di immersione è posto sul vetrino, e campioni vengono esaminati con un alto ingrandimento obiettivo olio (63x e 100x). Il filtro DAPI viene utilizzato per portare il campione a fuoco, il microscopio è poi passato al filtro appropriato (verde o rosso, a seconda del colorante usato per terminare le sonde-label) e le cellule di Salmonella sono segnato visivamente in base alla loro fluorescenza (figure 2 e 3). </li><li> Per il rilevamento mediante citometria di campioni liquidi miniculture superficie, vari strumenti possono essere utilizzati, a seconda della disponibilità locale. Nel nostro laboratorio, PBS, sospeso campioni vengono trasferiti in provette da 5 mL fondo di campionamento (BD Falcon) ed esaminato usando un citofluorimetro FACSCanto con eccitazione a 647 nm (tabella materiali). Per i campioni arricchito contenente un numero elevato di batteri totale, il &quot;basso flusso&quot; impostazione (10 L min -1) è usato e 5,000-50,000 eventi vengono raccolti. I dati sono analizzati utilizzando FlowJo software (versione 8.8.6, Albero Star, Inc., Ashland, OR) o altri software di analisi idoneo (Figura 4, pannelli A e B). </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. L&#39;uso di nastro adesivo per il campionamento di Salmonella spp. dalla superficie di un pomodoro artificialmente contaminata. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. I risultati tipici di direct-to-tape campionamento e l&#39;individuazione del pesce di Salmonella Typhimurium ATCC 14028 dalla superficie di un pomodoro (100 obiettivo olio X). Sonda a due cocktail di Texas Red sonde marcate (Sal3/Salm-63) è stato utilizzato ad etichettare queste cellule. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Microcolonie di Salmonella Typhimurium ATCC 14028 formata sulla superficie del xilosio lisina Tergitol-4 (XLT-4) agar dopo un h 8 su nastro di arricchimento a 37 ° C. L&#39;inoculo iniziale è stato prelevato dalla superficie di un pomodoro artificialmente contaminata. In fase solida arricchimento aumenta il numero di cellule disponibili per la rilevazione e migliora anche cellulari contenuto rRNA. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. L&#39;uso di nastro adesivo per il campionamento di S. enterica sierotipo Typhimurium dalla superficie di un pomodoro artificialmente contaminata, seguita da un&#39;analisi diretta tramite FISH e citometria a flusso (pannello A) o dopo 5 ore di arricchimento non selettivo liquido miniculture superficie in una camera di perfusione pieno di 500 microlitri Trypticase Soy Broth (pannello B ).

<ol>
	<li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples.">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li><li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape.">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adhesive-tape-based+sampling+of+tomato+surfaces+combined+with+rapid+fluorescence+in+situ+hybridization+for+Salmonella+detection.">Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 .</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-through+imaging+cytometry+for+characterization+of+Salmonella+subpopulations+in+alfalfa+sprouts,+a+microbiologically+complex+food+system.">Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system.</a> Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).</li><li>Edwards, R. W., Hartman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+collecting+fungus+specimens+from+infected+surfaces.">A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces.</a> Lloydia. 15, 39-39 (1952).</li><li>Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F., Pouch Downes, F., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+monitoring+of+the+food+processing+environment.">Microbiological monitoring of the food processing environment.</a> Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. , (2001).</li><li>Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+tape+method+for+estimating+microbial+load+on+meat+surfaces.">Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces.</a> J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).</li><li>Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+barley+(Hordeum+vulgare)+with+Salmonella+enterica+and+Listeria+spp.">Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).</li><li>La Cono, V., Urz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+applied+on+samples+taken+with+adhesive+tape+strips.">Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).</li><li>Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+controlling+microbiological+contamination+of+beverage+dispensers+in+university+foodservice+operations.">Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations.</a> Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).</li><li>Langvad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+qualitative+and+quantitative+study+of+the+fungal+flora+of+leaves.">A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves.</a> Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).</li><li>Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+fluorescence-labelled+oligonucleotide+probe+targeting+23S+rRNA+for+in+situ+detection+of+Salmonella+serovars+in+paraffin-embedded+tissue+sections+and+their+rapid+identification+in+bacterial+smears.">Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Metodi semplici e rapidi per l&#39;individuazione di agenti patogeni sulle superfici producono possono contribuire a mitigare le malattie di origine alimentare, fornendo dati tempestivi e fruibili. Nastro adesivo a base di metodi di campionamento sono stati utilizzati in termini ambientali, cliniche e microbiologia degli alimenti fin dal 1950 e coinvolgono pressione del tipo &quot;Scotch&quot; nastro alle superfici per la rimozione dei microrganismi, seguito dal diretto esame microscopico o il trasferimento di microrgan...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fungi-Tape sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL</td>
<td>745</td>
<td>http://www.scientificdevice.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Con-Tact-It sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Birko Corporation, Denver, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.birkocorp.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear office tape, generic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence</td>
</tr>
<tr>
<td>Food surface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local grocery</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypticase Soy Broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>211768</td>
<td>For non-selective liquid surface miniculture enrichment</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>223420</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>235310</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Formalin solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>HT5011</td>
<td>10% solution, neutral, buffered (cell fixative)</td>
</tr>
<tr>
<td>Absolute ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>E7023</td>
<td>Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RNase- and DNase-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slides and cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>S5150</td>
<td>Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>T9285</td>
<td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>L4522</td>
<td>10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies, Coralville, IA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5&#x2019;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified</td>
</tr>
<tr>
<td>Variable speed microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>CoverWell perfusion chamber </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR</td>
<td>PC1R-2.0</td>
<td>Non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>05-408-151</td>
<td>Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum heat block or precision-controlled heating station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Bambino mini hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 230300</td>
<td>Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide Moat slide hybridizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 240000</td>
<td>Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield H-1200 mounting medium with 4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td>
<td>H-1200</td>
<td>Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leitz Laborlux S used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canon PowerShot A640 camera used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used</td>
</tr>
<tr>
<td>Adobe Photoshop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Adobe Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometry analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combination of adhesive-tape-based sampling and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of salmonella on fresh produce

Questo protocollo descrive un metodo semplice per nastro adesivo a base di campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da su-nastro ibridazione in situ fluorescente (FISH) per una rapida indipendente dalla cultura di rilevamento di Salmonella spp. Nastri Cell-paga può anche essere posizionato a faccia in giù su agar selettivo per fase solida arricchimento prima rilevazione. In alternativa, a basso volume arricchimenti liquido (miniculture superficie liquida) può essere effettuata sulla superficie del nastro in brodo non selettivo, seguito da FISH e analisi mediante citometria a flusso. Per iniziare, nastro adesivo sterile è portato a contatto con prodotti freschi, una leggera pressione viene applicata, e il nastro viene rimosso, fisicamente estrazione microbi presenti su queste superfici. I nastri sono montati appiccicosa rivolta verso l&#39;alto su vetrini da microscopio in vetro e le cellule campionate sono fissati con formalina al 10% (30 min) e disidratati attraverso una serie graduata di etanolo (50, 80, e il 95%; 3 minuti per ogni concentrazione). Successivamente, cellule carica nastri sono macchiati con tampone contenente un cocktail mirato Salmonella sonda di DNA e ibridato per 15 - 30 min a 55 ° C, seguita da un breve risciacquo in un buffer di lavaggio per rimuovere la sonda non legata. Aderente, PESCE-etichettati cellule sono poi di contrasto con il DNA colorante 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ed i risultati sono visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Per la fase solida arricchimento, la cella a carica nastri sono disposti a faccia in giù su una superficie adatta agar selettivi e incubate per consentire la crescita in situ di microcolonie Salmonella, seguita dalla FISH e microscopia come descritto sopra. Per miniculture superficie del liquido, la cella a carica nastri sono disposti lato adesivo e una camera di perfusione di silicone viene applicato in modo che il nastro e far scorrere forma microscopio il fondo di una camera a tenuta stagna in cui un piccolo volume (≤ 500 mL) di Trypticase soia Broth (TSB) è introdotto. I condotti di aspirazione sono sigillati e le camere sono incubate a 35 - 37 ° C, permettendo una crescita a base di amplificazione del nastro estratto microbi. Dopo l&#39;incubazione, condotti di aspirazione sono sigillate, le cellule si staccano e mescolato con schiena vigorosa e indietro pipettaggio, raccolte tramite centrifugazione e fissato nel 10% formalina tamponata neutra. Infine, i campioni sono ibridate e esaminati attraverso la citometria a flusso per rivelare la presenza di Salmonella spp. Come descritto qui, il nostro approccio &quot;nastro-FISH&quot; in grado di fornire campionamento semplice e rapida e la rilevazione di Salmonella sulle superfici di pomodoro. Abbiamo inoltre usato questo metodo per il campionamento di altri tipi di prodotti freschi, tra cui spinaci e peperoni jalapeño.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Questo protocollo descrive un semplice nastro adesivo a base di approccio per il campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da una rapida individuazione cellule intere di<em&gt; Salmonella</em&gt; Usando fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH).

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

12.9K Views.  Colorado State University. Questo protocollo descrive un semplice nastro adesivo a base di approccio per il campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da una rapida individuazione cellule intere di Salmonella Usando fluorescenza In situ Ibridazione (FISH).

Video: Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Chiuso flusso degli acidi nucleici Citometria fluorescenza In situ Ibridazione (LNA flow-FISH): un metodo per la rilevazione dei batteri piccoli RNA

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Ibridazione<em&gt; In situ</em&gt; Delle ghiandole salivari, ovaie, e gli embrioni di Vector zanzare

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; su cromosomi mitotici di zanzare

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi